PPAR-γ及CTGF对肝癌细胞生长的影响及相互作用的研究

蔡 玮，张 芳，刘 伟，杨爱军，王晨昱，李 敏

（兰州大学基础医学院病理研究所，甘肃 兰州 730030）

过氧化物酶增殖激活受体-γ（peroxisome proliferators activated receptors，PPAR-γ） 是一类核转录因子[1]，可以调控肿瘤细胞分化，抑制肿瘤细胞增殖。结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF/）也与肿瘤细胞的增殖、血管的发生等方面相关[2]。有研究显示[3]，转录生长因子 -β（transeription growth factor β，TGF-β）是 CTGF上游的调控分子，在肿瘤细胞中，PPAR-γ与TGF-β的表达也相关[4]。本实验通过体外实验观察了PPAR-γ及CTGF对肝癌细胞增殖、侵袭及迁移的影响及两者之间的关系。

1 实验材料

兔抗人多克隆PPAR-γ抗体及兔抗人多克隆CTGF抗体（武汉博士德生物工程有限公司）。鼠抗人单克隆CTGF抗体（美国Santa Cruz公司）。SP免疫组化染色试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。人肝癌细胞株HepG-2由兰州大学基础医学院病理研究所提供。甲氮甲唑蓝（美国Sigma公司）。鼠尾胶（本实验室自制）。PPAR-γ激动剂-罗格列酮（rosgilitazone，RGZ）（浙江万马公司），完全溶于二甲亚砜，DMSO终浓度不超过0.1%。博依登小室（美国Millipore公司）。

1.1 实验方法

1.1.1 免疫组化检测HepG-2细胞中PPAR-γ及CTGF的表达 取对数生长期的HepG-2细胞制成单细胞悬液后爬片。免疫组织化学染色按试剂盒说明操作。制片后光镜下观察细胞，细胞浆或细胞核中出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.1.2 PPAR-γ对HepG-2增殖作用的影响 取对数生长期的HepG-2细胞制成单细胞悬液，调整密度为3×104/mL，悬浮于10%FBS的RPMI 1640培养液中，接种于96孔板，每孔200μL。待细胞帖壁后，吸去原培养基，加入终浓度分别为5、10、20、40和80μmol/L的RGZ，终体积为200μL。每个浓度级设4个复孔，每次设对照组（仅含二甲亚砜的RPMI 1640培养基）。加药后分别培养12、24、48和72 h，每孔加 MTT溶液 20μL，继续孵育 4 h，终止培养，小心吸弃上清，加二甲基亚砜150μL，振荡10 min，酶标仪测570 nm波长A值。重复3次试验，取均值。按以下公式计算，抑制率（inhibition rate，IR%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%。增殖率（growth rate，GR%）=（实验组 A值 /对照组 A值）×100%。

1.1.3 CTGF对HepG-2增殖作用的影响 细胞处理及加样方法同1.1.2。加入终浓度分别为5、10、20和50μg/mL的CTGF抗体，分别培养24、48、72 h，MTT检测方法及抑制率、增殖率计算公式同1.1.2。

1.1.4 PPAR-γ及CTGF对HepG-2侵袭性的影响 博依登小室下室加入含40%新生牛血清的RPMI 1640培养液，终体积为200μL。将3g/L的自制鼠尾胶按40μL/孔均匀地铺在博依登小室上下室之间的孔径为8μm的滤膜的上室面上，置37℃30 min聚合成凝胶。上室加入密度为1.0×106个/mL的HepG-2单细胞悬液（细胞预先在不含血清的RPMI 1640培养液中培养24 h），上室终体积为300μL。将小室置于6孔板内，培养48 h后用棉签头擦掉自制鼠尾胶，PBS洗3次，95%乙醇固定。对己穿透的细胞进行苏木素染色，相差显微镜观察、拍照并计数。每个滤膜分别计数随机5个视野内的穿膜细胞数后计算平均值。每组设3个平行小室，重复实验3次。

试验分为3组；A组：细胞不加处理组。B组：上室细胞预先用RGZ处理48h，浓度为40μmol/L。C组：上室细胞预先用CTGF抗体封闭处理48h，抗体浓度为10μg/mL。

1.1.5 PPAR-γ及CTGF对HepG-2细胞系迁移性的影响 方法两点不同：膜的上室面不铺胶；上室细胞浓度为6.0×105个/mL，分组同侵袭实验。

1.1.6 RT-PCR测定经PPAR-γ激动剂处理后CTGF的表达 设计引物序列如下：CTGF的上游引物5'-GCAGGCTAGAGAAGCAGAGC-3'，下游引物 5'-ATGTCTTCATGCTGGTGCAG-3'，产物大小为105 bp；内参β-actin的上游引物5'-TGGAGAAGAGCTATGAGCTGCCTG-3'，下游引物 5'-GTGCCA CCAGACAGCACTGTGTTG-3'，产物大小为202 bp。Marker由大连宝生物提供，序列号为D513A。RT-PCR引物设计参照有关文献，经基因库核实，由上海生物工程公司合成。细胞预先经RGZ处理（浓度为40μmol/L，处理48h），按Trizol试剂盒说明书提取细胞中的总RNA，反应条件为50℃逆转录30 min，94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，54℃退火 1 min，72℃延伸1 min，进行35个循环，最后72℃延伸7 min，琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统中拍照记录、分析结果。

1.2 统计学处理

2 实验结果

2.1 免疫组化检测HepG-2中PPAR-γ及CTGF的表达

图1 HepG-2细胞中PPAR-γ的表达（×200）

图2 HepG-2细胞中CTGF的表达（×200）

2.2 RGZ对HepG-2作用的时间及剂量依赖性

RGZ对HepG-2细胞增殖有明显的抑制作用，呈时间和剂量依赖性。与对照组相比，20～80μmol/L的RGZ可以抑制HepG-2细胞的生长，差异有统计学意义（P ＜0.05），而 5μmol/L、10μmol/L的RGZ对细胞生长抑制作用与对照组间差异无统计学意义（P ＞0.05），见图 3。

图3 RGZ对HepG-2作用曲线

2.3 CTGF抗体对HepG-2作用的时间及剂量依赖性

表1 不同浓度CTGF抗体处理后细胞抑制率差异（）

表1 不同浓度CTGF抗体处理后细胞抑制率差异（）

注：1）与对照组比较，P＜0.05；2）与对照组比较，P＜0.01

抗体浓度（μg/mL）IR（%）24h 48h 72h对照组 0 0 053.57±0.48 6.12±0.35 2.73±1.8710 13.66±1.072） 16.93±1.382） 11.22±1.85205016.5±0.322）28.02±1.642）20.75±1.792）31.00±1.272）15.37±1.511）27.06±1.242）

经CTGF抗体处理后，HepG-2细胞增殖有明显的抑制，抗体剂量越大，抑制率越明显。同一抗体浓度时，48 h抑制率达到最大值。细胞增殖的抑制呈时间和剂量依赖性。10～50μg/mL的CTGF抗体处理后，HepG-2细胞的生长与对照组相比明显受抑制，差异有统计学意义（P＜0.05），而5μg/mL组与对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

2.4 PPAR-γ及CTGF对HepG-2侵袭及迁移能力的影响

可以看出，与RGZ处理前（图4A）相比，处理后（图4B）侵袭穿膜细胞数目明显减少（图中深染的为苏木素着色的细胞核）。

侵袭实验：加入RGZ和CTGF抗体封闭处理后，与对照组相比，侵袭穿膜细胞数目减少，差异有统计学意义（P＜0.05），见表 2。

迁移试验：与对照组相比，PPAR-γ激动剂及CTGF抗体处理之后，迁移穿膜细胞数目都有所减少，差异有统计学意义（P＜0.05）。PPAR-γ处理组穿膜细胞数变化较CTGF处理组明显，变化趋势基本与侵袭试验一致，见表2。

图4 RGZ处理前后侵袭穿膜细胞数目的变化（苏木素染色×100）

表2 RGZ及CTGF抗体处理后HepG-2细胞侵袭及迁移能力的改变（）

表2 RGZ及CTGF抗体处理后HepG-2细胞侵袭及迁移能力的改变（）

注：†与A组比较，P＜0.05

组别 A组 B组 C组侵袭实验组 67.78±2.13 54.11±3.12† 56.82±4.25†迁移实验组 89.32±3.57 75.89±5.24† 80.55±3.69†

图5 RGZ处理前、后CTGF的表达

2.5 经RGZ处理前、后CTGF的表达

表3 RGZ处理前、后CTGF mRNA的表达（）

表3 RGZ处理前、后CTGF mRNA的表达（）

组别 CTGF mRNA未处理组 0.7841±0.0403处理组 0.5783±0.0332

HepG-2细胞中，CTGF有表达，经RGZ处理后CTGF的表达相对于未处理组降低，见图5，表3。

3 讨论

PPAR是核激素受体超家族的成员，它是由英国科学家ISSEMANN和GREEN[5]于1990年首先发现的。该受体有3种亚型：PPAR-α、PPAR-γ和PPAR-β-δ，这3种亚型在结构及功能上均有差异[6]。PPAR-γ与配体结合后被激活，其配体包括天然配体和合成配体两类。天然配体主要有：必需脂肪酸及其代谢产物，如亚麻酸、亚油酸、花生四烯酸等。人工合成激动剂，如噻唑烷二酮类也就是格列酮类药物，包括吡格列酮、罗格列酮、曲格列酮、环格列酮等。

起初对于PPAR-γ的研究主要集中在糖尿病方面，近年来对PPAR在肿瘤发生、发展过程中的影响作用的研究也日渐增多，尤其是γ亚型，与肿瘤关系最为密切。研究发现，PPAR-γ位于机体多种信号传导的交叉点，其被配体激活后可通过抑制细胞增殖、诱导细胞凋亡等途径发挥抗肿瘤作用，有望成为肿瘤化疗的一个新途径。研究还表明，PPAR-γ活化后抗癌机制主要通过调节细胞周期[7]、诱导凋亡[3]、抑制COX-2表达[8]等途径来实现。

本文的研究证实，加入PPAR-γ的激动剂后，HepG-2细胞的生长受到不同程度的抑制，呈剂量及时间依赖关系，且在48 h内，抑制率的改变最具意义，与国外文献报道一致[9]。进一步通过博依登小室的侵袭和迁移实验证实，PPAR-γ对细胞侵袭和迁移也同样发挥调控作用，加入PPAR-γ激动剂后，肝癌细胞侵袭和迁移能力受到抑制，说明PPAR-γ在肝癌的转移过程中发挥着一定的作用，抑制了肝癌细胞的生长、转移。

CTGF是 CCN家族成员之一，1991年由RADHAM等[10]首先在人类脐静脉内皮细胞的条件培养基中发现了人类的CTGF（hCTGF）。目前所发现的 CCN家族包括 Cry61，CTGF，Nov，W ISP-1，W ISP-2和W ISP-3六个成员。在发现伊始，对于CTGF的研究主要集中在纤维化方面，各种研究证实，CTGF是纤维化形成过程中的重要介质[4]。

近年来，CTGF与肿瘤的关系也逐渐受到重视。研究发现，胰腺癌、软骨肉瘤中CTGF的表达升高[11]，在约61%的急性淋巴细胞白血病患者的骨髓中也出现CTGF的过度表达[12]。CCN是一组功能复杂的基因，它们不仅参与正常机体的生长调控，而且与肿瘤有密切联系，在肿瘤生长、血管生成、转移等生物学过程中起重要作用，且功能复杂多样。CTGF在肿瘤中的具体作用，目前还不是很清楚。

本文在对CTGF的研究过程中发现，加入CTGF的抗体封闭之后，HepG-2细胞的增殖受到抑制，也呈剂量及时间依赖关系，且肝癌细胞的侵袭及迁移能力也有所下降。CHANG等的研究也有相似的结果[13]。

RT-PCR检测经 RGZ事先处理（40μmol/L、48h）及未处理组的CTGF的表达的改变发现，处理组CTGF的表达相对于未处理组下降，提示PPAR-γ参与调控HepG-2的生长，部分是通过改变CTGF的表达来实现的。在肝脏组织中，不仅在纤维化的过程中PPAR-γ-CTGF途径发挥重要的作用，在肝癌的发展过程中，PPARγ-CTGF通路同样存在并且发挥调控作用。

PPAR-γ及CTGF都是近几年才被发现与癌症的发生、发展相关的因子，对于其具体的调控机制及作用通路研究并不十分明确，而发现PPAR-γ-CTGF途径，无疑为相关的研究和临床治疗提供了一个新的方向。

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