NDV+IL-12联合应用抗小鼠S180肉瘤作用的实验研究

蒋丽娜，程建贞，刘 华，刘雪晴，张晓丽，翟登高，吕占军

（1.河北北方学院 免疫教研室，河北 张家口 075000；2.河北北方学院 检验系示范中心，河北 张家口075000；3.河北北方学院 实验中心，河北 张家口 075000；4.河北医科大学 实验动物部）

应用免疫生物学手段治疗肿瘤是抗肿瘤免疫研究的热点。近年来，新城疫病毒（new castle disease virus，NDV）和一些细胞因子联合抗肿瘤作用的研究日益受到重视。白细胞介素（interleukin 12，IL-12）是由巨噬细胞等抗原提呈细胞产生的异二聚体细胞因子，具有多种生物学活性，不仅对肿瘤有直接的抑制作用，而且能有效激发和调节细胞免疫应答，使机体免疫系统有效发挥抗肿瘤作用[1]。本文对小鼠S180实体瘤模型采用NDV、IL-12、NDV+IL-12进行免疫治疗研究，通过T细胞亚群测定、CTL细胞杀瘤效应等研究，从细胞免疫的角度分析了NDV联合IL-12抗肿瘤作用的机制，为深入研究NDV抗肿瘤作用机制，以及研制更加有效的抗肿瘤疫苗奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 四甲基氮噻唑蓝（thiazolyl blue，MTT）为北京市普京康生物工程技术有限公司进口分装产品。DMEM培养基为美国Gibco公司产品。藻红蛋白（phycoerythrin，PE）标记的大鼠抗小鼠CD4单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）标记的大鼠抗小鼠CD3单克隆抗体、别藻青蛋白（APC）标记的大鼠抗小鼠CD8单克隆抗体及鼠重组IL-12试剂购自深圳晶美生物有限公司。

1.1.2 动物 BALB/c小鼠，18～20 g，雌性，由河北医科大学实验动物中心提供。

1.1.3 病毒和细胞株 NDV从中国科学院病毒所购买，血凝效价为1：800++，用PBS稀释病毒至1×1010PFU/mL；S180细胞株由河北医科大学实验动物部提供。

1.2 方法

1.2.1 动物造模 于BALB/c小鼠左后肢皮下接种2×106个瘤细胞，荷瘤成功后，开始抑瘤实验。

1.2.2 实验分组和给药 将40只荷瘤成功的小鼠随机分为4组，每组为10只。

生理盐水（对照组）：荷瘤第7、14及21 d，每只小鼠瘤旁注射生理盐水0.2 mL。

NDV免疫治疗组：荷瘤第7、14及21 d，每只小鼠瘤旁注射NDV 0.2 mL（即2×109PFU/只/次）。

0.5ng/mL IL-12免疫治疗组：荷瘤第7、14及21 d每只小鼠瘤旁注射IL-120.2 mL。

NDV+0.5 ng/mL IL-12联合免疫治疗组：荷瘤第7、14及21天每只小鼠瘤旁注射0.1 mL NDV（即1×109PFU/只/次），同时在瘤体对侧位右后肢皮下注射0.1 mL IL-12。

1.2.3 抑瘤率和瘤指数的检测 末次治疗1星期后，各组动物同时全部处死，剥离瘤体称重，计算抑瘤率和瘤指数。

1.2.4 小鼠脾CTL活性测定 取脾细胞悬液（2×107/mL）0.25 mL做效应细胞，加入S180靶细胞悬液（2×106mL）0.05 mL，使效靶比为50︰1。体外培养14 d，用酶标仪检测。

1.2.5 外周血中T淋巴细胞亚群的检测 收集各组小鼠摘取的眼球抗凝血，采用直接免疫荧光-流式细胞术，测定外周血中CD3+T、CD4+T细胞和CD8+T细胞的百分率，并计算CD4+/CD8+比值，P＜0.05为差异有显著性。

1.3 统计学分析

应用SPSS13.0统计学软件分析。各项数据均以（均数±标准差）（）表示。多样本比较采用方差分析，如有统计学意义，采用LSD法进行两两比较。

2 结果

2.1 小鼠的一般情况观察

自第14日后，生理盐水组小鼠一般状况变差，逐渐出现精神萎靡、行动迟缓、毛发干涩；而同期的NDV组、IL-12组、NDV和IL-12组、小鼠一般状况明显优于生理盐水组。

2.2 各实验组小鼠抑瘤率和瘤指数的比较

NDV+IL-12组的抑瘤率与NDV、IL-12组相比P＜0.01，NDV组和IL-12组进行比较，差异无显著性（P ＞0.05）（表 1）。

生理盐水组小鼠瘤指数为（7.67±0.67），NDV组、IL-12组、NDV+IL-12组的小鼠瘤指数分别为（5.26±0.49）、（5.51±1.35），（3.95±0.49）、明显低于生理盐水组（P＜0.01）；NDV组、IL-12单独治疗组小鼠与NDV+IL-12组相比，差异有显著性（P＜0.01）；NDV组小鼠瘤指数与IL-12组相比，差异无显著性，P ＞0.05（表 1）。

表1 各组荷瘤小鼠的瘤指数和抑瘤率的变化 （）

表1 各组荷瘤小鼠的瘤指数和抑瘤率的变化 （）

注：1）与生理盐水组相比，P ＜0.01；2）与NDV+IL-12组相比P＜0.01

组别 动物数（只）体重（g）瘤重（g）抑瘤率（%） 瘤指数生理盐水组 10 23.31±1.511.78±0.12 - 7.67±0.67 NDV 组 10 23.63±2.131.24±0.1730.26±9.251）2） 5.26±0.491）2）IL-12 组 10 22.93±1.911.22±0.1331.85±7.241）2） 5.51±1.351）2）NDV+IL-12 组 10 23.24±2.550.91±0.0748.96±3.801） 3.95±0.491）

表2 各组荷瘤小鼠CTL细胞活性的比较（）

表2 各组荷瘤小鼠CTL细胞活性的比较（）

注：1）与生理盐水组相比，P ＜0.01；2）与 NDV+IL-12组相比 P ＜0.01；3）与 IL-12组相比，P＜0.05

组别 动物数（只） CTL活性生理盐水组 10 25.05±1.20 NDV 组 10 47.03±3.551）2）3）IL-12 组 10 35.19±3.931）2）NDV+IL-12 组 10 63.84±3.381）

表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T细胞亚群百分率（%）表达的比较 （%，）

表3 荷瘤小鼠和正常小鼠血液中T细胞亚群百分率（%）表达的比较 （%，）

注：1）与生理盐水组相比，P ＜0.05；2）与 NDV+IL-12组相比，P ＜0.05；3）与 IL-12组相比，P＜0.05

组别CD3 CD4 CD8 CD4/CD8正常对照组生理盐水组68.00±7.0740.86±4.2045.70±5.5028.68±4.1325.00±2.9711.96±1.021.82±0.182.41±0.42 NDV组IL-12组NDV+IL-12组56.26±2.791） 42.18±2.211） 15.96±1.221）3） 2.65±0.1555.12±6.631）2） 39.65±5.081） 14.53±1.731） 2.73±0.3064.53±9.201） 48.08±8.911） 17.92±1.561） 2.68±0.44

2.3 脾CTL细胞活性的检测

从表 2 可以看出，NDV、IL-12、NDV+IL-12 组的CTL细胞活性与生理盐水组相比有显著性差异（P＜0.01）；NDV+IL-12组的CTL细胞活性比NDV、IL-12组要高（P＜0.01）；IL-12组的CTL细胞活性低于NDV组（P＜0.05）。

2.4 荷瘤小鼠血液中T细胞亚群的变化

从表3可见，生理盐水组荷瘤小鼠血液中CD3+T、CD4+T、CD8+T细胞百分率均低于 NDV、IL-12、NDV+IL-12组。结果表明，采用NDV、IL-12单独治疗或NDV+IL-12联合治疗后，上述指标均得到明显改善（P＜0.05），且 CD4+/CD8+比值也升高。

3 讨论

肿瘤的发生、发展及预后与机体的免疫功能，特别是与细胞免疫功能有着密切的关系。细胞免疫在机体的免疫监视及抗肿瘤免疫中具有极为重要的作用[2]。提高机体免疫功能是抗肿瘤作用的一条重要途径[3，4]。

在本研究中，我们采用NDV、鼠源性IL-12和NDV+IL-12联合分组接种，比较观测了各组对荷瘤小鼠的免疫效果。结果显示，NDV、IL-12和NDV+IL-12具有良好的抗肿瘤效果。NDV与IL-12联合免疫比单独应用NDV、IL-12效果更好，肿瘤生长受到明显抑制，而且CD3+、CD4+细胞百分率与正常小鼠相当，但是CD8+细胞百分率明显低于正常小鼠，CD4/CD8比率明显高于正常小鼠。另外，NDV、IL-12单独治疗组CD4+、CD8+细胞百分率及比率方面也显示类似情况，提示CD4+T细胞的抗肿瘤作用可能比CD8+T细胞更重要。原来认为，抗肿瘤细胞免疫主要是由CTL介导的，但是近年来证实，CD4+T细胞在有效的抗肿瘤免疫应答中也起着关键的作用[5]，本文的实验结果也初步说明，CD4+T细胞在抗肿瘤作用中具有重要作用。

IL-12是诱导细胞免疫极为关键的细胞因子，即能诱导CD4+T细胞向Th1细胞分化，也能刺激T细胞和NK细胞分泌IFN-γ，促进NK细胞、T细胞增殖和增强CTL细胞毒活性[6～8]。良好的抗肿瘤状态需要Th1细胞占优势[9，10]，增强Th1细胞功能，提高机体细胞免疫能力，可成为抗肿瘤免疫治疗的手段之一[11～14]。NDV作为活的病毒能很好地诱导体液和细胞免疫应答，用NDV+IL-12联合免疫小鼠，能人工改善应答环境，有利于CD4+T细胞向Th1细胞转化，可能是抗瘤效果好于NDV、IL-12单独免疫的重要原因。

治疗组CD3+T细胞百分率明显高于生理盐水对照组，提示S180肉瘤生长可能有抑制T细胞活化、增殖及破坏T细胞的作用，从而降低了小鼠的抗肿瘤作用，其机制需要深入研究。另外，本研究显示，NDV组小鼠CTL活性及百分率明显高于IL-12组，可能NDV的抑瘤作用好于IL-12，但是CD4+T细胞百分率、抑瘤率和抑瘤指数并无明显差别，需要延长实验时间进一步观测。

综上所述，不论采用NDV、IL-12单独治疗还是NDV+IL-12联合治疗，在体内都具有一定的的抗肿瘤作用，细胞免疫方面的指标（CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+）均得到明显改善，提高了细胞免疫功能。本研究结果提示，联合免疫效果好于单独免疫，其详细协同抗肿瘤作用机制有待深入研究。

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