VEGF、bFGF低频超声透皮给药系统对猪超长筋膜皮瓣存活的影响

吕 川 陶 然 张敬德 宋建星 王晓云 杨 超

VEGF、bFGF低频超声透皮给药系统对猪超长筋膜皮瓣存活的影响

吕 川 陶 然 张敬德 宋建星 王晓云 杨 超

目的应用VEGF和bFGF，以透皮低频超声导入的无创给药方法，比较单一药物和联合用药对猪超长宽比例筋膜皮瓣成活率及其微循环的影响，为扩大超长宽比例筋膜皮瓣的临床应用奠定实验基础。方法选用10只猪为实验动物。在猪背部两侧设计3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，分为空白超声对照组、超声导入VEGF组、超声导入bFGF组、注射VEGF+bFGF联用组、超声导入VEGF＋bFGF联用组等5组。术后10 d，测量皮瓣成活面积，测定毛细血管密度以及表达指数，并进行定量分析。结果超声导入VEGF＋bFGF联用组皮瓣成活率、毛细血管密度及表达指数等，均明显优于其他4组，差异有显著性（P＜0.01）。结论VEGF和bFGF经皮联合低频超声介导给药应用于猪超长宽比例筋膜皮瓣，可显著提高皮瓣的成活率。

血管内皮生长因子碱性成纤维生长因子低频超声经皮给药超长皮瓣筋膜皮瓣

临床上，组织缺损创面极其常见，早期进行良好的组织覆盖是修复缺损创面的重要条件。筋膜皮瓣，是最常用的一种修复方法，但由于其血供特点，长宽比例通常不能超过3∶1，限制了其在临床的应用。提高超长宽比例筋膜皮瓣的成活率可以提高其在临床的应用。本研究采用血管内皮细胞生长因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）和碱性成纤维细胞生长因子（Basic fibroblast growth factor，bFGF），借助低频超声透皮导入系统的无创给药方法，应用于超长宽比例的筋膜皮瓣，观察皮瓣的成活率及其微循环的变化，以扩大超长宽比例筋膜皮瓣在临床的应用。

1 材料和方法

1.1 动物及分组

选用10只猪为实验对象。在背部两侧对称设计3 cm×15 cm的筋膜皮瓣，方向与躯干纵轴垂直，每侧分成5组：A组为空白超声对照组，予低频超声处理；B组为低频超声经皮导入VEGF组；C组为低频超声经皮导入bFGF组；D组注射VEGF＋bFGF，于缺血部位多点注射，3次/日；E组以低频超声经皮导入VEGF＋bFGF。低频超声使用功率为20 kHz/3 W·cm2，每次15 min，3次/日。自手术之日起各组按设计连续处理5 d。术后每日观察皮瓣颜色、质地、温度、术后肿胀情况等。术后10 d观察皮瓣成活情况。

1.2 主要试剂和仪器

重组人VEGF165和重组人bFGF（PEPROTECH公司，美国）。低频超声导入仪BM-628型，MIQAS医学图像定量分析系统，Leica DMRXA2研究型全自动显微镜，OLYMPUS BH2生物显微镜。

1.3 观察指标

1.3.1 皮瓣存活面积及成活率

术后10 d取材，发黑干燥区域为坏死区域。用透明硫酸纸准确描绘各组皮瓣形态，坏死区域涂黑。利用CMIAS-2001A真彩色图像分析系统计算透明纸上染黑区与未染黑区的灰度值，精确测量皮瓣的成活面积与总面积，并计算成活率。

1.3.2 毛细血管密度测定

切取组织标本，按照近、中、远各1/3等分为3份，每块组织再分为4等份，各切片1张行HE染色，光镜下观察组织学变化。在100倍光镜下每张切片随机选择12个视野进行毛细血管计数，计算出组织中毛细血管的密度（个/cm2），统计分析中端和远端1/3的密度。

1.3.3 人抗VEGF和人抗bFGF免疫组化荧光染色

每条皮瓣中点处取材，制成石蜡标本，连续切片2张，1张行人抗VEGF染色，另1张行人抗bFGF染色。染色后每张切片均在生物显微镜下拍照，对阳性结果进行定量分析，测定标本阳性面积和光密度，计算出阳性指数。

1.4 统计学方法

利用SPSS 13.0统计分析软件进行多样本方差分析，P＜0.01为差异有显著性。

2 结果

2.1 皮瓣成活率

各组间存在显著差异，E组皮瓣存活率较其他4组高，且有显著性差异（P＜0.01）（表1，图1）。

图1 各组皮瓣存活情况

2.2 毛细血管密度测定

2.2.1 中端1/3毛细血管密度

E组皮瓣存活率较A组及B、C组高（P＜0.01），但与D组无差异（P＞0.05）（表2）。

表1 各组皮瓣存活率比较

表2 各组中端1/3毛细血管密度比较

2.2.2 远端1/3毛细血管密度

A组皮瓣坏死，数据缺如。E组皮瓣存活率明显高于其他3组（P＜0.01）（表3）。

表3 各组远端1/3毛细血管密度比较

2.3 VEGF、bFGF表达阳性指数的统计学分析

按α=0.05水准，E组VEGF、bFGF的表达均高于其他各组（P＜0.01）（表4、5）。

表4 各组皮瓣VEGF阳性指数比较

表5 各组皮瓣bFGF阳性指数比较

3 讨论

超声透皮给药，是指超声可以增强包括大分子药物在内的许多药物的透皮传输。1954年，最早报道了用超声成功导人氢化可的松药膏治疗手指关节的多发性关节炎[1]，之后一系列实验证明超声对很多药物的渗透是有效的[2]，且低频超声（f＜100 kHz）提高皮肤通透性的效果最佳[3]。当低频超声用于透皮给药时，空化作用是其最主要的机制[4]。它具有其他给药方式不可比拟的优点：①在皮瓣局部存在血运障碍时，静脉或口服等全身给药方法使药物很难随血液流动到达缺血部位；透皮给药将药物直接作用于缺血部位，可使局部迅速达到有效血药浓度。②适用药物较广，不限于小分子药物或水溶物质等，大分子蛋白如胰岛素、VEGF等亦可使用。③可使药物在全身或局部长时间产生较恒定的血药浓度，且可调控，从而优化药效，减轻不良反应。④与注射给药和静脉给药相比，可避免长期反复注射带来的疼痛，还可避免局部或血路感染的潜在危险。⑤与口服给药相比，大分子蛋白类药物避免了胃肠道降解的过程，大大提高了生物效价。⑥应用安全，超声停止后皮肤屏障功能即可迅速恢复。

VEGF的主要生物学功能是促进血管内皮细胞增殖，具有刺激内皮细胞增殖、迁移、发芽作用，还具有增强血管通透性的作用[5]。bFGF是目前已知最强的促细胞生成因子，诱导内皮细胞萌芽、增殖，增加血管通透性[6-7]。两者联合应用的优势在于VEGF和bFGF都是血小板相关生长因子，它们共同维持血管内皮细胞的成活和增殖[8-9]，可以协同地促血管生成，使促血管作用更强，并形成差异性互补，使缺血区快速血管化，以达到临床治疗的目的[10－12]。用两者共同刺激体外培养的毛细血管内皮细胞，在同样的条件下，其细胞数目要比单独用任何一种时多2～8倍[13]。Ley等[14]研究发现，当bFGF与VEGF剂量在3∶1时所产生的协同效应最强。本研究证实，同等效价的两种药物经低频超声联合应用，较之于单独应用或联合注射给药，能够更加有效地促进内皮细胞增殖，进而增大皮瓣成活面积、扩大筋膜皮瓣的长宽比例。另外，在实际应用中，通过给药系统，仅在局部小剂量应用，安全性较高；可以较长时间持续给药，避免因药物的半衰期过短而导致的血药浓度无法维持。

目前，在动物实验研究中证实低频超声经皮给药具有良好的安全性和有效性，然而各类动物皮肤的通透性、屏障作用以及对超声产生的能量耐受敏感度与人类皮肤均存在差异，需进一步研究以确定不同药物的最佳使用频率。另外，低频超声经皮给药系统仍需基础、临床和医用工程学三者的紧密结合，实现仪器的专门化、实用化、微型化，以利于超声透皮给药的临床推广和应用。我们相信，本方法的日趋成熟，将使超长宽比例筋膜皮瓣的临床应用范围更加广泛，为各种组织缺损的修复提供更加简单、有效的解决途径。

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The Application of VEGF and bFGF Via Low-Frequency Ultrasound-Mediated Transdermal Drug Transport System in the Improvement of Maximizing Survival of Fascio-Cutaneous flap with Super Length Ratio in Pigs

LU Chuan,TAO Ran,ZHANG Jingde,SONG Jianxing,WANG Xiaoyun,YANG Chao.Corresponding author:YANG Chao. Department of Plastic Surgery,Changhai Hospital Affiliated the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China.

PurposeTo explore the effects of single or combined application of VEGF and bFGF via the noninvasive medication of ultrasound-mediated transdermal drug transport(UMTDT)in the survival rate and microcirculation of fasciocutaneous flap with big ratio of length to width.MethodsA total of 100 fascio-cutaneous flaps were performed on the sides of the back in ten pigs.The flap area ranged from 3 cm×15 cm.These flaps were randomly divided into 5 groups as follows. A:control group with blank ultrasound;B:VEGF by low-frequency UMTDT;C:bFGF by low-frequency UMTDT;D:VEGF and bFGF by localized injection in multiple points;E:VEGF and bFGF by low-frequency UMTDT.The quantitative analysis of the vitality of the flaps,capillary intensity and expression index were observed 10 days after operation.ResultsThere was significant difference between the group of combined medication of both and bFGF via UMTDT and the other four groups in flap survival rate,capillary intensity and expression index.ConclusionThe combined medication of VEGF and bFGF via UMTDT can significantly enhance the survival rate of fascio-cutaneous flaps with big ratio of length to width.

Vascular endothelial growth factor(VEGF);Basic fibroblast growth factor(bFGF);Low-frequency ultrasound; Transdermal drug delivery;Super long flap;Fascio-cutaneous flap

R622+.9

A

1673－0364（2010）01－0021－03

2009年12月29日；

2010年1月19日)

10.3969/j.issn.1673-0364.2010.01.006

200433上海市上海第二军医大学附属长海医院整形外科。

杨超。