培养基组成对米曲霉产氨基酰化酶的影响

氨基酸的制备方法有蛋白质水解法、微生物发酵法和化学合成法等，其中化学合成法因成本低、适于大规模生产等优点而独具优势。但市场大量需要的是单一构型的氨基酸，而化学合成法得到的产物为外消旋混合物，必须通过手性拆分才能得到单一构型的产品。高效、绿色、安全的氨基酰化酶法是拆分氨基酸的最佳方法之一，目前人们主要应用该方法拆分化学合成法生产的氨基酸DL-消旋体。

氨基酰化酶又称N-酰化氨基酸亚胺基水解酶或酰化酶，是一类能够水解N-酰基-DL-氨基酸上酰胺键的酶。具有光学异构专一性，能够选择性地水解N-酰基-DL-氨基酸[1]，通过分离即可得到光学纯L-或D-氨基酸。因此，高活力和高立体选择性的氨基酰化酶的生产菌株的选育和产酶条件的优化，是高效、低成本制备氨基酸的基础。

氨基酰化酶的来源很广，已经发现的氨基酰化酶广泛存在于各种动植物的器官内、微生物胞内或发酵液中。氨基酰化酶的制备方法有动植物组织提取法和微生物发酵法，由微生物发酵法制备的氨基酰化酶比动植物提取法制备的更稳定、更经济、底物专一性更强。

目前，用于氨基酸拆分的氨基酰化酶大多由米曲霉发酵得到。 虽然氨基酰化酶不是米曲霉的主要酶系，但由于其生长速度快、酶活性高、底物专一性强，尤其适于α-氨基和羟基消旋物特别是外消旋氨基酸的大规模拆分。因此，由米曲霉发酵制备大量高活性的氨基酰化酶对化工产品的后续加工非常重要。

作者在此对诱变而得的最优米曲霉菌株的发酵条件进行优化，探求从外界环境进一步提高米曲霉产氨基酰化酶的能力，以使氨基酰化酶的产量和质量达到工业生产的需求，为工业化、规模化生产奠定基础。

1 实验

1.1 材料、试剂与仪器

米曲霉菌株,实验室诱变所得；麸皮，自购。

N-乙酰-DL-蛋氨酸，张家港市华昌药业有限公司；其余试剂均为国产分析纯。

SHZ-82型气浴恒温振荡器，721型可见分光光度计，YXQG02型手提式电热压力蒸汽消毒器，SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台，各种玻璃器皿。

1.2 培养基

斜面培养基:马铃薯200 g，切块煮沸30 min，过滤得清液，自来水补足1000 mL，加入葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，pH值自然，1×105Pa灭菌30 min。

初始发酵培养基:麸皮0.6 g，蛋白胨0.6 g，硫酸镁0.03 g，磷酸二氢钾0.06 g，水30 mL，pH值自然，1×105Pa灭菌30 min。

1.3 方法

1.3.1 斜面培养

接种PDA斜面，于30℃培养4 d，产生大量绿色孢子。

1.3.2 发酵培养

用无菌水分2次洗下斜面上的孢子，在玻璃珠三角瓶内150 r·min-1振荡15 min，制得孢子悬液。接种3 mL孢子悬液于30 mL发酵培养基中，于30℃、150 r·min-1培养48 h,收获培养物。发酵液抽滤,将菌丝体用蒸馏水冲洗3次,抽干,称重。

1.4 酶活测定

取1 g菌体放入100 mL三角瓶中，加入pH值7.0的磷酸缓冲溶液10 mL、0.2 mol·L-1的N-乙酰-DL-蛋氨酸溶液10 mL，于37℃、150 r·min-1摇床振荡1 h，过滤，滤液在水浴中煮沸10 min，使酶失活。

采用茚三酮显色法测定拆分出的L-蛋氨酸的物质的量(mmol·L-1)：将上述滤液稀释一定倍数，取稀释后滤液1 mL，加入pH值5.4的2 mol·L-1醋酸缓冲溶液1 mL和茚三酮显色液1 mL，混匀后于沸水浴中加热15 min，自来水冷却放置5 min后，加入3 mL60%乙醇稀释，摇匀后用721型分光光度计测定OD570。根据标准曲线计算反应液L-蛋氨酸的物质的量。

酶活定义[2]：在37℃、pH值为7.0的条件下，1 g湿菌体1 h拆分所产生的L-蛋氨酸的微摩尔数。

根据下式计算酶活:

式中：C为L-蛋氨酸的物质的量，mmol·L-1；V为酶促反应的总体积，L(本实验为0.02 L)；N为稀释倍数；t为摇瓶时间，h(本实验为1 h)；M为湿菌丝用量，g(本实验为1 g)；1000为μmol与mmol的换算基数。

2 结果与讨论

2.1 碳源及其含量的选择

固定培养基的其它条件不变，考察碳源对米曲霉菌株产氨基酰化酶的影响，结果见图1。

图1 碳源对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图1可看出，碳源对氨基酰化酶的酶活影响很大。以葡萄糖、蔗糖、淀粉、玉米粉作为碳源时，氨基酰化酶的酶活很低；以麸皮为碳源时，酶活最高；以乳糖或CMC作碳源时,酶活很高,但菌体量很低。这可能是因为，麸皮不但可以提供菌体生长所需的碳水化合物,而且其含有的微量因子可能对氨基酰化酶的产生有促进作用，同时麸皮能增强培养基的通透性，利于好氧菌的生长[3～5];而以乳糖和CMC作为碳源时，由于菌体大量产酶的同时影响了菌体本身的生长，所以尽管酶活很高，但菌体量很低，而且用CMC作为碳源的发酵液极其粘稠，不易分离。因此，选择麸皮为适宜的碳源。

以麸皮为碳源，考察其含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响，结果见图2。

图2 麸皮含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图2可看出，麸皮含量为1.5%时，氨基酰化酶的酶活最高；随着麸皮含量的增加，菌体量明显增加，酶活反而下降。这可能是麸皮中某种微量元素的增加造成的，该元素可能特异性促进菌体生长，而不促进或者抑制酶的分泌。

2.2 氮源及其含量的选择

固定培养基的其它条件不变，考察氮源对米曲霉菌株产氨基酰化酶的影响，结果见图3。

图3 氮源对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图3可看出，选用无机氮源时氨基酰化酶的酶活较低，而有机氮源大多能提高氨基酰化酶的酶活，其中尿素为氮源时的酶活最高。因此，选择尿素为适宜的氮源。

陈曦等[6]报道,培养基的不同成分可诱发产生不同的酶；孙春华等[7]报道，尿素对米曲霉产蛋白酶的影响很小；从本实验可看出，尿素对米曲霉产氨基酰化酶有很大的影响。以尿素为氮源，考察其含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响，结果见图4。

图4 尿素含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图4可看出，当尿素的含量为1.5%时，米曲霉产氨基酰化酶的酶活最高。

2.3 磷酸盐及其含量的选择

磷在微生物生长繁殖过程中起着重要作用,它既是合成核酸、磷脂等含磷化合物的重要元素,又是代谢过程中许多酶或辅酶的重要组成元素。

以发酵培养基为基础,考察磷酸盐对米曲霉产氨基酰化酶的影响，结果见图5。

图5 磷酸盐对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图5可看出，在含磷酸二氢钠的培养基中，米曲霉产氨基酰化酶的酶活较高。因此，选择磷酸二氢钠作为磷酸盐。

磷酸二氢钠含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响见图6。

图6 磷酸二氢钠含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图6可看出，当磷酸二氢钠含量为0.2%～0.4%时，酶活较高；当其含量大于0.6%后，对米曲霉产氨基酰化酶不仅没有促进作用，反而有所抑制。这可能是由于随着磷酸二氢钠含量的增加，发酵培养基的pH值下降较大，因而抑制了菌体产酶。

2.4 表面活性剂及其含量的选择

Tween-80等表面活性剂通常可以增强菌体细胞膜的通透性,利于菌体摄取营养成分,并能促进酶等代谢物分泌到胞外。郭海风[8]报道，表面活性剂对米曲霉产β-葡萄糖苷酶并无促进作用。固定培养基其它条件不变，考察表面活性剂对米曲霉产氨基酰化酶的影响，结果见图7。

图7 表面活性剂对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图7可看出，与不加任何表面活性剂相比，在培养基中加入表面活性剂Tween-80对酶活的增加稍有促进，其中加入0.1% Tween-80效果更好；而加入Span-80则稍有抑制。因此，选择在培养基中加入0.1%的Tween-80。

2.5 镁离子及其含量的选择

添加镁离子有利于米曲霉产酶[9]。固定培养基其它条件不变，考察镁离子含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响，结果见图8。

图8 Mg2+含量对米曲霉产氨基酰化酶的影响

从图8可看出，随着Mg2+含量的增加，酶活逐渐升高；在Mg2+含量为0.2%～0.3%时，酶活达到最高；而后酶活随着Mg2+含量的增加反而降低；当Mg2+含量达到0.6%后，酶活的变化不大。因此，在培养基中加入适量Mg2+可以促进产酶。

2.6 正交实验

根据单因素实验结果，培养基的碳源、氮源、磷酸盐及镁离子对米曲霉产氨基酰化酶均有较大影响，进一步采用L9(34)正交实验确定最佳的培养基组成，实验结果与分析见表1。

从表1可知，各因素对米曲霉产氨基酰化酶影响大小依次为：硫酸镁>尿素>麸皮>磷酸二氢钠，其培养基中最适含量为：麸皮2%、尿素1.5%、磷酸二氢钠0.3%、硫酸镁0.35%，添加Tween-80 0.1%。以此培养基发酵3批样品，平均酶活为440.51 μmol·g-1·h-1。

3 结论

通过单因素实验，确定最佳碳源为麸皮，最佳氮源为尿素，磷酸盐、镁离子、Tween-80对米曲霉产氨基酰化酶均有促进作用。通过正交实验确定最优培养基为：麸皮2%、尿素1.5%、磷酸二氢钠0.3%、硫酸镁0.35%、Tween-80 0.1%，酶活可高达440.51 μmol·g-1·h-1。与优化前相比，单位酶活提高6倍左右。

表1 正交实验结果与分析

参考文献：

[1] Chibata I,Ishikawa T,Yamada S.L-Amio acid production by aminoacylase fromAspergillus[J].Bull Agr Chem Soc Japan,1957,21:300-306.

[2] 王淑豪，宋正孝，马忠海,等.米曲霉3042的液体培养特性及其产氨基酰化酶的特性研究[J].食品科学，2000，21(7)：9-11.

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[4] Kitano H,Kataoka K,Furukawa,et al.Specific expression and temperature-dependent expression of the acid protease-encoding gene(pepA) inAspergillusoryzaein solid-state culture(rice-koji)[J]. J Biosci Bioeng, 2002, 93(6): 563-567.

[5] 石开风，曹飞，周华,等.米曲氨基酰化酶液态发酵条件的研究[J].食品与发酵工业，2004，30(7)：78-81.

[6] 陈曦,赵建国.饲用酶高产菌株的筛选[J].饲料工业，2006,27(6): 14-15.

[7] 孙春华，燕磊，常维山.不同碳源和氮源对米曲霉产酶影响的研究[J].西南农业学报，2007，20(5)：986-990.

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[9] 董静,孟宪军.米曲霉UC6-90产曲酸的发酵培养基优化[J].食品研究与开发，2007，28(6)：52-56.