表面等离子体共振生物传感器在食品安全检测中的应用与研究

戴明

（福建省中心检验所，福建 福州 350002）

表面等离子体共振生物传感器在食品安全检测中的应用与研究

戴明

（福建省中心检验所，福建 福州 350002）

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）传感技术是一项新兴的生物化学检测技术，具有无须标记、高速、高灵敏度等特点。目前在化学和生物检测研究中应用日益广泛。本文综述了SPR技术的基本原理及近年来在食品安全领域研究中取得的进展，并展望了SPR技术的发展方向及应用前景。

表面等离子体共振（SPR）；食品安全；检测

表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance，SPR）传感技术是一项新兴的生物化学检测技术。它是基于表面等离子体共振的物理光学现象的敏感折射率的高精度光学传感器，通过感测传感器表面的折射率微小变化而实现生物分子的传感，是研究生物分子相互作用的有力工具,其具有无须标记、高速化、专一性、灵敏度高以及大量平行筛选等优点。自从1982年被应用于气体测定和生物传感研究，20多年来得到科学界越来越多的关注。各种新型的配置形式及其在物理、化学、生物领域的应用得到广泛研究。随着表面等离子体共振技术的发展成熟，多家仪器公司实现了相关检测仪器的商品化，该类设备成为实时分析，简便快捷地监测DNA与蛋白质之间、蛋白质分子之间以及药物—蛋白质、核酸—核酸、抗原—抗体、受体—配体等等生物分子之间的相互作用的重要手段，在生命科学、医疗检测、药物筛选、食品检测、环境监测、毒品检测、法医鉴定等领域具有广泛的应用需求。

一、SPR基本原理

表面等离子体共振（SPR）是一种物理光学现象。它是利用金属表面电荷波动（表面等离子波）在某一适当的入射角或波长与入射光TM极化能量（消失波）耦合产生表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）。如果金属表面介质的折射率或被测物介电常数发生变化, 共振峰的位置（共振角或共振波长）将发生改变[1]。因此通过测定共振角（或波长）变化, 就可获得被测物在界面上发生反应的信息。

在基于SPR原理的生物传感器中，使用最多、应用最广泛的是GE公司生产的Biacore仪器，并由此发展出生物分子相互作用分析技术（Biomolecular Interaction Analysis,BIA）。在BIA的测定中是通过在SPR传感器反应界面上修饰一层配体分子, 当被分析物与配体分子结合后, 共振峰的位置会发生位移, 该位移的大小将反映固定在金属表面的物质的量, 进而监测分子间相互作用，其检测原理如图1所示。

由于SPR生物传感器具有灵敏度高、实时快速、样品无需标记等突出优点，因而有关SPR传感器的研究与应用得到迅猛发展。目前SPR生物传感器已由最初的生物大分子相互作用（例如：蛋白质－蛋白质、药物－蛋白质、蛋白质－核酸、核酸－核酸之间的相互作用分子间）研究逐渐发展到用于环境污染物和食品安全中众多小分子化合物的检测。

二、SPR技术在食品品质与安全检测中的应用

随着表面等离子共振传感技术在食品检测领域逐渐为人们接受，关于SPR生物传感器的分析研究与论文也不断增加，其应用于食品安全与品质的检测主要包括病原体、毒素、药物残留、维生素、荷尔蒙、抗体、化学污染物、过敏源和蛋白。

（一）病原体

近年来，SPR传感技术已用于各种病原体的检测，其中包括细菌、病毒、真菌和寄生虫。早在1998年，Fratamico 等[2]就用SPR检测手段测定可大肠杆菌O157:H7（E.coli O157:H7）。随后，大量的SPR技术检测大肠杆菌O157:H7的工作被陆续报道。Choi’s课题组[3]利用商品化的SPR仪—Multiskop测定大肠杆菌O157:H7，他们在芯片上先修饰一层蛋白G来固定抗E.coli O157:H7抗体然后直接检测E.coli O157:H7，其检测灵敏度可达104/cell。2006年 Subramanian等[4]在芯片表面修饰硫醇自组装膜，氨基偶联法将抗E.coli O157:H7多克隆抗体固定在芯片上，利用夹心SPR检测法测定，灵敏度可达103cfu/mL。2007年，Waswa等[5]利用Speeta SPR仪，先将生物素化的抗E.coli O157:H7抗体固定到预先修饰有中性链亲和素的金膜表面，这种抗体固定方式大大改善了方法的灵敏度，可实现牛奶、苹果汁、碎牛肉等复杂体系中E.coli O157:H7的检测，其检测限可达102-103cfu/ml。Zezza等[6]测定了小麦里的黄色镰刀菌。先提取样品中DNA，再将黄色镰刀菌的特异性DNA片段放大，然后检测扩增物，通过与已固定在SPR芯片表面的互补序列杂化检测黄色镰刀菌。

（二）毒素

食品安全所涉及的毒素主要是由细菌、真菌、水藻所产生的。2000年，Nedelkov等[7]用Biacore X SPR仪在葡聚糖芯片表面氨基偶联抗金黄色葡萄球菌肠毒素B（Staphylococcal Enterotoxin B，SEB）抗体，直接检测牛奶和蘑菇的SEB量可低至1ng/ml[8]。SPR仪后串接一个MALDI-TOF来对已结合的毒素确证。Medina等[9]利用商品化Biacore1000 SPR仪，竞争SPR法检测鸡蛋里的SEA (金黄色葡萄球菌肠毒素A)。首先将SEA氨基偶联在葡聚糖芯片上。生鸡蛋碾碎均匀后离心，然后向其中加入抗SEA抗体，待SEA和其抗体反应后离心，使得抗原-抗体结合物与未反应的抗体分离。取上清液，注样使样品流过SEA芯片表面。该方法的SEA检测限可达1ng/ml。Lotierzo等[10]采用Biacore 3000，在芯片上修饰分子印迹聚合物作为识别元素采用竞争SPR法测定软骨藻酸DA。具体做法是将含有DA和辣根过氧化物酶修饰的DA的样品与以DA为模板的分子印迹聚合物竞争反应。2005年，Yu等[11]采用抑制法用自行搭建的SPR仪测定DA。Traynor等[12]也利用抑制SPR法测定了贝壳提取物中的DA。

（三）兽药

SPR生物传感技术应用的另一个重要领域就是食品中兽药残留检测[13]（例如：抗生素、β-阻断剂、抗寄生虫药），且目前这方面的应用还在不断增加。Cacciatore等[14]检测了牛奶中抗生素含量（盘尼西林、头孢），他们利用β-内酰胺类抗生物对digoxigenin标记氯苄青霉素与水溶性肺炎链球菌盘尼西林结合蛋白2×衍生物结合产生非竞争抑制作用，使用的是Biacore 3000 SPR仪将抗digoxigenin抗体预先固定在芯片上。测得牛奶中各种抗生素的检出限如下:苄青氯素、氨苄青霉素、阿莫西林2ng/ml，邻氯青霉素15ng/ml，头孢氯苄50ng/ml，头孢哌酮钠25ng/ml。Ashuin等[15]测定了食物中氯霉素和氯霉素葡萄糖苷酸。他们测定了蜂蜜、虾、乳制品中的氯霉素和猪肾里的氯霉素葡萄糖苷酸可低至0.2μg/kg。Dumont等[16]利用Biacore Q抑制检测法测定了虾体内残留的氟苯尼考（fenicol）。2007年Moeller等[17]报道了蜂蜜和牛奶中的四环素（tet）药物的检测。该方法的机理是四环素从四环素操纵子（tetO）中释放出四环素遏制蛋白（TetR）对革兰氏阴性菌中四环素产生遏制。含有四环素操纵子序列的biotinated-单链DNA固定在链霉亲和素芯片表面上，然后TetR与芯片表面的tetO结合，注入含有四环素的样品使四环素与TetR反应，TetR蛋白构型发生变化从芯片表面脱离，SPR检测到的是芯片表面密度的减少。缓冲溶液中tet的检测限为1ng/ml，牛奶和蜂蜜中的分别为15ng/ml和25μg/kg。

（四）激素

Gillis等[18，19]测定了奶牛新产乃中甾体类激素黄体酮。黄体酮衍生物氨基偶联固定在葡聚糖表面上，一定已知浓度的单克隆抗体与样品（缓冲溶液或牛奶）孵育一段时间。SPR检测为反应抗体的量。早在2002年他们就测定了生乳牛奶中黄体酮的含量可低至3.6ng/ml[18]。2006年他们又改进方法将缓冲夜和牛奶黄体酮中检测限降至60pg/ml和0.6ng/ml[19]。

（五）过敏源

Mohammed等[20]利用商品微型化SPR仪—Spreeta测定可花生过敏原，检测限为700ng/ml。Malmheden Yman等[21]将鸡蛋白、伴白蛋白、芝麻蛋白、花生蛋白、榛仁蛋白、蟹肉等过敏原的亲和纯化抗体氨基偶联在葡聚糖芯片上，利用Biacore Q SPR仪比较了直接检测和夹心检测两种模式，实验结果表明夹心法中的二抗提高了检测的灵敏度和特异性。巧克力中的花生蛋白稀释10倍后检测限可达1μg/g，通心粉中的伴白蛋白则达1μg/g，芝麻蛋白为0.25μg/g。

（六）化学污染物

Samsonona等[22]使用Biacore Q SPR仪抑制法测定了贝壳中4-壬基苯酚。9-羟苯基壬酸氨基偶联在葡聚糖涂层上，采用单克隆抗体检测，缓冲溶液中检测限为2ng/ml。整个检测过程包括30秒钟的重生也只需花不到3min。芯片可用10% 100mM NaOH的乙腈溶液重生，降低了实验成本。检测贝壳中4-壬基苯酚的浓度最低可到10ng/ml。一般，用重组牛生长激素处理过的牛奶中会发现一种可疑致癌物：胰岛素样生长因子（IGF）。Guidi等[23]先将胰岛素样生长因子-1（IGF-1）固定在葡聚糖膜上，anti-IGF-1多克隆抗体与样品孵育2小时后采用的是抑制免疫检测法。据报道，缓冲溶液和牛奶中IGF-1检测量都可低至10ng/ml。

三、SPR技术的前景展望

SPR作为生物传感器具有生物样品无需标记，分析样品无需纯化，且可实时监测反应动态过程等优点，它在生命医学、食品及环境科学等领域有着巨大的市场潜力，但与之前广泛应用的免疫检测方法相比，在价格、灵敏度、稳定性方法须进一步改进：

（一）降低实验成本

一台进口商品化的SPR仪需人民币200～300万元，使用过程中还要不断地消耗昂贵的耗材芯片，SPR实验高额成本无形中影响了SPR传感器的研究和应用。目前国内已有许多研究小组都自行搭建了SPR传感装置，大大降低了实验成本。

（二）阵列化、高通量分析

由于SPR技术每次只能分析几个样品，且每次分析需要大约5～10min，高通量检测提高了检测效率，参考通道的引入也确保了测量结果的精确度和可信度。

（三）提高检测灵敏度

SPR技术对待测物浓度的测定主要与物质的分子量有关，对于分子量大于1000的物质，其典型的可测定浓度范围为μmol/L-nmol/L，而对于分子量小于1000的物质，其典型的可测定浓度范围为μ mol/L-mmol/L。因此，积极探索各种高灵敏度的分析方法来检测小分子已成为SPR研究中的一个主要内容。可通过对传感器结构进行优化、传感新机制进行研究来达到此目的。

[1]Englebienne P,Van H,Verhas M, Surface plasmon resonance: principles, methods and applications in biomedical sciences, Spectroscopy 2003, 17: 255[2]Fratamico P M,Strobaugh T P,Medina M B, Gehring A G, Biotechnol. Tech.1998,12: 571.

[3]Oh B K,Kim Y K,Bae Y M,Lee W H,Choi J W,J.Microb.Biotechnol.2002,12: 780.

[4]Subramanian A,Irudayaraj J,Ryan T,Biosens.Bioelectron.2006, 21:998.

[5]Waswa J,Irudayaraj J DebRoy C,LWT-Food Sci.Technol. 2007, 40: 187.

[6]Zezza F,Pascale M, Mule G,Visconti A,J. Microbiol.Methods 2006, 66: 529.

[7]Nedelkov D,Rasooly A,Nelson R W,Int.J.Food Microbiol.2000, 60:1.

[8]Nedelkov D,Nelson R W,Appl.Environ.Microbiol.2003,69:5212 .

[9]Medina M B,J.Rapid Methods Autom.Microbiol.2006,14:119.

[10]Lotierzo M,Henry O Y F,Piletsky S,Tothill I,Cullen D,Kania M,Hock B,Turner A P F,Biosens.Bioelectron.2004,20:145.

[11]Yu Q M,Chen S F,Taylor A D,Homola J, Hock B,Jiang S Y,Sens.Actuators B 2005,107:193.

[12]Traynor I M,Plumpton L,Fodey T L,Higgins C,Elliott C T,J.AOAC Int.2006, 89:868.

[13]Haughey S A,Baxter CA,J.AOAC Int. 2006,89:862.

[14]Cacciatore G,Petz M,Rachid S,Hakenbeck R,Bergwerff A A,Anal.Chim.Acta 2004,520:105.

[15]Ashwin H M,Stead S L,Taylor J C,Startin J R,Richmond S F,Homer V,Bigwood T,Sharman M,Anal.Chim.Acta 2005,529:103.

[16]Dumont V,Huet A C,Traynor I,Elliott C,Delahaut P,Anal.Chim.Acta 2006,567:79.

[17]Moeller N,Mueller-Seitz E,Scholz O,Hillen W,Bergwerff A A,Petz M,[J]Eur.Food Res.Technol.2007,224:285.

[18]Gillis E H,Gosling J P,Sreenan J M,Kane M,J.Immunol.Methods 2002,267:131.

[19]Gillis E H,Traynor I,Gosling J P,Kane M,J. AOAC Int.2006,89:838.

[20]Mohammed I,Mullett W M,Lai E P C,Yeung J M,Anal.Chim.Acta 2001,444:97.

[21]Malmheden Yman I,Eriksson A,Johansson M A,Hellenas K E,J.AOAC Int.2006,89:856.

[22]Samsonova J V,Uskova N A,Andresyuk A N,Franek M,Elliott C T,Chemo- sphere 2004,57:975.

[23]Guidi A,Laricchia-Robbio L,Gianfaldoni D,Revoltella R,Del Bono G,Biosens.Bioelectron.2001,16:971.

Development of Surface Plasmon Resonance Technique in theAnalysis of Food Safety

DAI Ming
(Fujian Provincial Central Inspection Institute, Fuzhou 350002, Fujian, China)

Surface plasmon resonance (SPR) biosensor developed rapidly in the recent years by merit of its obviation of sample labeling, rapidness and high sensitivity. The principle and development of SPR technique in analysis of environment pollution substance and food safety analysis was reviewed and tread of SPR in the above area was also prospected.

surface plasmon resonance (SPR); food safety; detection

2009-02-20

戴 明，男，福建省中心检验所食品化学产品检验部，工程师，理学博士