蝙蝠葛碱抑制肺癌细胞QG－56增殖的实验研究

石玉生，张艳，王加志，张金良

(黑龙江中医药大学佳木斯学院，黑龙江 佳木斯 154007)

北豆根始载于《中国药植志》［1］是防己科植物蝙蝠葛(Menispermum dauricum DC)的干燥根茎，为北方习用中药，性味苦、寒，有清热解毒、祛风止痛的功效。现代药理学证明，其具有抑菌、降压和抗心律失常等作用，常用于治疗咽喉肿痛、肠炎痢疾和风湿痹痛等症。北豆根在治疗扁桃体炎、咽喉肿痛、牙龈肿痛方面有良好的效果，用北豆根总碱制成的片剂和注射液已广泛应用于临床，而关于其抗肿瘤作用国内外报道较少。文献报道，北豆根中主要化学成分为生物碱 ，其主要有效成分为蝙蝠葛酚性生物碱(phenolic alkaloids of menis permum dauricum，PAMD)，对多种组织来源的肿瘤细胞增殖有很强的抑制作用，而且可以诱导肿瘤细胞凋亡，具有逆转肿瘤多药耐药作用［2～4］。本课题组分离得到蝙蝠葛酚性生物碱中的主要成分蝙蝠葛碱，研究表明，其对肿瘤细胞增殖有很强的抑制作用，为蝙蝠葛碱作为抗癌新药的进一步开发提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 肿瘤细胞株 人肺癌细胞株QG－56。

1.2 肿瘤细胞株悬液制备 常规方法培养，待细胞进入对数生长期后，收集细胞，用RPMI1640培养液调浓度为1×105个·mL－1的细胞悬液备用。

1.3 蝙蝠葛碱的制备 北豆根干品经95%乙醇浸泡过夜，加热回流提取3次，提取液浓缩，再以3%HCl溶解，将水相调节pH=9，过滤得到酚性总碱，再用萃取法得到纯化的蝙蝠葛碱。

1.4 细胞培养 人肺癌细胞株QG－56细胞用含10%胎牛血清、青霉素(100U·mL－1)、链霉素(100mg·mL－1)的 RPMI 1640培养基培养，在37℃，5%CO2以及饱和湿度条件下培养。倒置显微镜下观察细胞生长状态，细胞生长呈70%～80%融合状态时，以0.25%胰蛋白酶消化传代，隔日换液，每3～4d传代1次。

1.5 MTT法检测细胞增殖反应 取对数生长期人肺癌细胞株QG－56细胞，调整细胞浓度为1×105个·mL－1，接种于96孔培养板，每孔100μL。在培养箱中培养24h后，吸出各孔内培养基，加入含有不同蝙蝠葛碱(1.125、2.25、5.5、11、22μg·mL－1)的培养基，每孔200μL，并设空白对照组，每组设6个复孔，继续培养24、48或72h，培养结束前4h，向各培养孔加入 MTT(5mg·ml－1)10μL，继续培养 4h，弃去上清，每孔加入10%DMSO 150μL，振荡器震荡10min后，用全自动酶标仪检测各孔的光密度值(OD)，检测波长490nm，参考波长620nm。计算药物对细胞抑制率。抑制率(%)=(1－实验组OD值/对照组OD值)×100%。上述实验重复3次。

2 结果

蝙蝠葛碱(Dau)能有效抑制癌细胞株QG－56细胞增殖。MTT分析结果显示，与溶剂对照组相比，Dau在3.125～50μg·mL－1浓度范围内对细胞增殖有明显的抑制作用，作用24h对QG－56细胞增殖的抑制率分别为(4.6±1.15)%，(12.47±2.13)%，(28.33±3.12)%，(47.25±4.13)%，(62.61±3.68)%;48h抑制率分别为(6.62±4.12)%，(22.32±2.18)%，(40.43±4.15)%，(52.34±1.68)%，(82.86±1.69)%;72h抑制率分别为(16.16±3.68)%，(32.65±2.89)%，(51.23±3.82)%，(62.35±2.63)%，(91.23±0.86)%，抑制率随着Dau浓度的增加而增加，存在明显的剂量－效应关系。不同浓度Dau之间的抑制率比较，具有统计学差异(P<0.05)，以22μg·mL－1Dau作用72h抑制率最高(为91.23%)(Table 1)。

Table 1 Effect of Dau on proliferation of QG－56 Lung cancer cells(±s)

Table 1 Effect of Dau on proliferation of QG－56 Lung cancer cells(±s)

Dau content Treatment times(μg·mL－1) 24h(%) 48h(%) 72h(%)1.125 4.6±1.15 6.62±4.12 16.16±3.68 2.25 12.47±2.13 22.32±2.18 32.65±2.89 5.5 28.33±3.12 40.43±4.15 51.23±3.82 11 47.25±4.13 52.34±1.68 62.35±2.63 22 62.61±3.68 82.86±1.69 91.23±0.86

3 讨论

总之，文献对于蝙蝠葛碱的抗肿瘤作用罕有报道，仅有北豆根的有效成分之一蝙蝠葛碱的逆转肿瘤多药耐药等相关报道［5，6］。田代华著《实用中药辞典》中，谓北豆根可用于治疗消化道癌症［7］。本文使用人肿瘤细胞株QG－56作为代表细胞株，结果表明，蝙蝠葛碱有明显的抑制肿瘤细胞株增殖反应的作用，蝙蝠葛碱对QG－56癌细胞的抑制作用机制还有待于进一步研究。蝙蝠葛碱是生物碱类成分，有较好的脂溶性，具有易进入细胞、体内分布广泛等优点，通过本实验及进一步的研究可以为北豆根在抗肿瘤方面的开发提供科学依据，对于蝙蝠葛碱的临床应用及对恶性肿瘤防治，提供宝贵的实验依据。

［1］高学敏.中药学［M］.北京:人民卫生出版社，2000:532.

［2］Yang J，Liu X，Bhalla K，et al.Prevention of Apoptosis by Bcl22:release of cytochrome f rom mitochondria blocked［J］.Science，1997，275(5303):1129－1132.

［3］尹蕊，苏慧，邵成文，等.蝙蝠葛酚性碱对BXPC－3荷瘤小鼠细胞凋亡基因p53表达的影响［J］.中医药学报，2009，37(6):35－37.

［4］苏云明，刘坤，章艳，等.蝙蝠葛酚性碱对BXPC－3肿瘤抑制作用及肿瘤组织中 MMP－9含量的影响［J］.中医药学报，2010，38(1):33－34.

［5］LI Jian－hua，QIN Feng－qi，YANG Pei－man.Reversal of multidrug resistance in human K 562/ADM cell line by dauricine［J］.Journal of Dalian Medical University，2002，24(2):94－96.

［6］CUI Liao，PANG Yi－sheng.Inhibitory effects of tetrandr ineand dauricine on growth of HL－ 60 and K 562 cell lines［J］.Chinese Pharmacological Bulletin，1995，11(6):478－781.

［7］田代华.实用中药辞典［M］.第1版.北京:人民卫生出版社，2002:493－495.