蛇胆菠萝蛋白酶肠溶薄膜衣片质量标准研究

2010-06-01蒋伟杰聂倩庆陈小霞

中国药业 2010年9期

蒋伟杰，聂倩庆，陈小霞

（1.广东省江门市新会人民医院，广东江门 529100； 2.广东省江门市新会区新城医院，广东江门 529100；3.广东药学院，广东广州 510006）

蛇胆菠萝蛋白酶肠溶薄膜衣片为医院制剂，主要成分有蛇胆汁、菠萝蛋白酶，具有消除组织水肿、抗炎、化痰止咳等作用。为确保制剂疗效，笔者参照文献[1-4]建立了蛇胆汁的鉴别方法及菠萝蛋白酶的活力测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

78X-2型片剂四用测定仪（上海黄海药检仪器厂）；751GD型紫外分光光度计（上海精密科学仪器有限公司）；ZF-2型三用紫外仪（上海安亭电子仪器厂）。菠萝蛋白酶（南宁市罐头厂，效价800 U/mg）；蛇胆菠萝蛋白酶肠溶薄膜衣片及阴性样品（新会人民医院自制）；蛇胆汁[新会人民医院采制，蛇的品种有眼镜蛇 Naja naja （L.），眼镜王蛇 Ophiophagus Hannah，金环蛇 Bungarus fasciatus，银环蛇 Bungarus multicintus Blyth，百花锦 Elaphe moellendorffi，三索蛇 Elaphe radiate，水律蛇 Ptyas mucosus，过树榕蛇 Ptyas korross，乌梢蛇 Zaocys dhumnade（Cantor）等]；酪氨酸及酪蛋白（中国药品生物制品检定所）；硅胶G（青岛海洋生物制品厂）；试剂为分析纯，水为二次蒸馏水。

2 方法与结果

2.1 样品处方

每1 000片含蛇胆汁200 g，菠萝蛋白酶10 000 kU（约12.5 g）。

2.2 阴性样品及蛇胆汁制备

按处方制备不含蛇胆汁、菠萝蛋白酶的片剂，得蛇胆汁及菠萝蛋白酶的阴性样品。取动物蛇的胆，保存于含乙醇50%以上的米酒中，蛇胆与酒的比例为 1∶1（g/g），用时除去胆衣，混匀即可[3]。

2.3 片剂通则检查

片剂脆碎度：取样品10片，置片剂四用测定仪（转速25 r/min）中测定 4 min，取出，浸入盐酸溶液（9→1 000）中，5 min后取出，用滤纸擦干，观察片面，不得有渗水、溶胀、裂缝等现象。

崩解时限：在经脆碎度检测的片剂中取6片，照2005年版《中国药典（二部）》附录方法测定[3]。先在盐酸溶液（9→1 000）中检查2 h，每片均不得有裂缝、崩解或软化现象；用少量蒸馏水洗涤后，再在磷酸盐缓冲液（pH=6.8）中检查，1 h内应全部崩解。

2.4 蛇胆汁薄层色谱鉴别[2，7]

取样品1.5 g，加乙醇5 mL，搅匀，温热约1 h，振摇，滤过，滤液作为供试品溶液；同法制备阴性对照品溶液；另取蛇胆汁对照药材，加乙醇制成5 g/L的溶液，作为对照药材溶液；按2.5.1项下方法制备菠萝蛋白酶对照品溶液。照薄层色谱法[2005年版《中国药典（一部）》附录Ⅵ B]试验，吸取上述4种溶液各3 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以异戊醇-冰醋酸-水（9∶3∶1）为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，于105℃下加热至斑点显色清晰，置紫外光灯（365 nm）下检视。供试品溶液色谱中，在与对照药材溶液和对照品溶液色谱相应位置上，分别显相同颜色的荧光斑点（图1）。

图1 薄层色谱图

2.5 菠萝蛋白酶效价测定[1，5-6]

2.5.1 溶液制备

取盐酸半胱氨酸5.27 g，加水500 mL溶解，另取乙二胺四醋酸二钠2.23 g，加水200 mL溶解，合并两液并混匀，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液调pH至4.5，加水稀释至1 000 mL，即得盐酸半胱氨酸缓冲液。取105℃下干燥至恒重的酪氨酸适量，精密称定，加0.1 mol/L盐酸溶液制成质量浓度约50 μg/mL的酪氨酸对照品溶液。取硅胶干燥器中干燥至恒重的酪蛋白0.6 g，精密称定，置烧杯中，加0.05 mol/L磷酸氢二钠溶液80 mL，置65℃水浴溶解，放冷，用1 mol/L盐酸溶液调pH至7.0，转移到100 mL量瓶中，加水至刻度，作为底物溶液（用时现配）。取样品10片，精密称定，研细，精密称取适量（含菠萝蛋白酶约50 kU），加少量盐酸半胱氨酸缓冲液，搅拌并转移至100 mL量瓶中，加盐酸半胱氨酸缓冲液至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，用盐酸半胱氨酸缓冲液稀释至刻度，即得供试品溶液。取三氯醋酸1.8 g、无水醋酸钠2.99 g、冰醋酸液1.9 mL，用水溶解并稀释至100 mL，即得三氯醋酸溶液。精密称取菠萝蛋白酶适量（约200 kU），加少量盐酸半胱氨酸缓冲液，搅拌并转移至100 mL量瓶中，加盐酸半胱氨酸缓冲液至刻度，即得菠萝蛋白酶对照品溶液。

2.5.2 测定方法

精密量取供试品溶液1.0 mL，置具塞试管（15 mm×130 mm）中，置37℃水浴预热5 min，精密加入37.0℃预热的底物溶液5.0 mL，立即振摇，置37℃水浴中准确反应10 min，加三氯醋酸溶液5.0 mL，振摇，置37℃水浴中准确放置40 min；用干燥滤纸滤过，取续滤液，照分光光度法[2005年版《中国药典（二部）》附录ⅣA]，以水为空白，在275 nm波长处测定吸光度 A；再精密量取供试品溶液1.0 mL，加三氯醋酸5.0 mL，振摇，精密加入底物溶液5.0 mL，同法操作，测定吸光度 A0；另取酪氨酸对照品溶液，以水为空白，在275 nm波长处测定吸光度 As。按下式计算标示量：标示量=（AA0）/As·Ws/W·11/10·n·平均片重 /平均标示量×100%。式中 n为供试品的稀释倍数，W为供试品的取样量，Ws为对照品溶液每1 mL中含酪氨酸的量。

2.5.3 方法学考察

线性关系考察：精密量取对照品溶液，分别配制成效价浓度为30，40，50，60，70 U/mL 的菠萝蛋白酶测定液，分别取上述测定液并按2.5.2项下方法测定，以测定液效价浓度对测定效价值进行线性回归，得回归方程 Y=23.5 X+12.5，r=0.996 5（n=5）。结果表明，菠萝蛋白酶测定液效价浓度在30～70 U/mL范围内与效价值线性关系良好。

稳定性试验：取供试品溶液，分别于0，1，2，3 h时测定效价。结果的 RSD=0.65%（n=4），表明供试品溶液在3 h内稳定。

干扰性试验：取含蛇胆汁不含菠萝蛋白酶的阴性样品，依法测定。结果表明，阴性样品不干扰测定。

回收率试验：称取阴性片剂粉末2.5 g（约10片），共6份，以2份为1组，分别精密加对照品溶液20，25，30 mL，相当于菠萝蛋白酶为标示量的80%，100%，120%，置100 mL量瓶中，依法测定效价。结果见表1。

表1 菠萝蛋白酶回收率试验结果（n=6）

3 讨论

蛇胆汁是本药的主要成分之一，由于不同种属的蛇的胆汁成分有很大差异，且无统一标准，笔者参照文献[2，7]，以蛇胆汁作为对照药材，对该药蛇胆汁成分进行薄层析鉴别，该法简易行。

菠萝蛋白酶在胃液中易被破坏而失活，应制成肠溶衣片[4-6]。考虑到该药品为肠溶薄膜衣片，为避免其肠溶衣在运输和使用过程中摩擦受损，确保药品疗效，特设了片剂脆碎度检查，并于测定后取样进行崩解度检查。效价测定[1，5]是将酪蛋白水解为酪氨酸，用紫外光谱法测定酪氨酸含量，从而计算酶的效价。在上述条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1 μg酪氨酸相当的菠萝蛋白酶量为1活力单位，药品效价应为标示量的85.0% ～120.0%。菠萝蛋白酶不稳定，反应时间、温度、浓度的影响相对较大[5-6]，故测定结果可能有偏差。本试验证明，采用文中所述方法时，该药的蛇胆汁及辅料等成分不干扰效价测定，结果偏差在可控范围内，可作为标准依据。

重现性试验：取同一批（批号为B01）样品6份，分别精密称定，依法制备供试品溶液并测定。结果每片平均效价相当于标示量的98.57%，RSD=0.64%（ n=6）。

2.5.4 样品效价测定

依法测定了3批样品，结果见表2。