铽离子荧光增敏洛美沙星及其含量测定

聂松柳，戚雪勇，张怀敬，何 华

（1.安徽省六安市人民医院药剂科，安徽 六安 237005； 2.江苏大学药学院，江苏 镇江 212001；3.中国药科大学分析化学教研室，江苏 南京 210009）

洛美沙星（lomefloxacin，LFLX）是新一代广谱氟喹诺酮类抗菌药物，抗菌活性强、抗菌谱广、不良反应小，用于治疗泌尿系统、呼吸道、前列腺等细菌感染性疾病，效果良好。洛美沙星的含量测定方法较多，如紫外分光光度法[1-2]、荧光分析法[3-5]、化学发光法[6]、原子吸收法[7]、高效液相色谱法[8-11]、毛细管电泳法[12]、伏安法[13]、非水滴定法[14]、微生物检测法[15]等，但这些方法各有优势和不足，在简便性、灵敏性、专属性和稳定性等方面有待完善和提高。因此，有必要探索能同时进行洛美沙星体内和体外分析的新方法。

1 仪器与试药

RF-5301PC型荧光分光光度计（日本，岛津）；FTIR-8400S型红外光谱仪（日本，岛津）；FA 1004型电子天平（上海天平仪器厂）；pHS-2C型酸度计（上海雷磁仪器厂）。天门冬酸洛美沙星对照品（法国巴黎十一大药学院赠送）；Tb4O7（上海跃龙有色金属有限公司）；盐酸洛美沙星胶囊（南京第二制药厂）；其他试剂均为分析纯，水为双蒸水（本实验室自制）。

2 方法与结果

2.1 溶液配制

TbCl3溶液的配制：称取 （MTb=159，MTb4O7=748）0.074 8 g Tb4O7，滴加盐酸（1∶1）数滴，并加入几滴H2O2，小心加热使其溶解，待蒸至近干，用水于100 mL量瓶中定容，配成4.0×10-3mol/L的Tb3+离子贮备液，置冰箱中保存。

洛美沙星贮备液：称取天门冬酸洛美沙星对照品（M=466）0.046 6 g，用水于100 mL量瓶中定容，配成1.0×10-3mol/L的对照品贮备液，冰箱中保存。临用前吸取1 mL，置100 mL量瓶中，用水定容，配成1.0×10-5mol/L的工作溶液。

醋酸-醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L）：将适当体积的0.1 mol/L醋酸和适当体积的0.1 mol/L醋酸钠溶液混和，在酸度计上调节至所需pH。

Tris-HCl缓冲液（0.1 mol/L）：取三羟甲基氨基甲烷12.41 g，加水800 mL，搅拌溶解，并稀释至 1 000 mL，用 6 mol/L盐酸溶液在酸度计上调节至所需pH。

2.2 测定方法

于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星贮备液2.5 mL、Tb3+离子溶液 1.25 mL、pH=6.0的醋酸 -醋酸钠缓冲液2 mL，水定容，摇匀。以320 nm为激发波长，545 nm为发射波长，用1 cm石英池，在荧光分光光度计上测定其荧光强度，激发和发射狭缝均为5 nm。

2.3 荧光测定条件选择

图1 荧光光谱图

激发波长和发射波长：光谱图见图1。洛美沙星在273 nm和320 nm波长处有最大两个激发波长，洛美沙星与Tb3+生成络合物后峰位基本没有位移，且275 nm波长处的强度明显增大（图1 A）。由图1 B可见，洛美沙星的荧光峰位于435 nm波长处，但当它与Tb3+离子结合后，其自身435 nm波长处的荧光峰则显著减小，而在490，544，590，620 nm波长处产生了铽的特征荧光峰（峰形较窄），它们分别对应于Tb3+的5D4→7F6，5D4→7F5，5D4→7F4，5D4→7F3跃迁。由 Tb3+水溶液的荧光光谱可知，Tb3+的荧光强度极弱。由此可见，Tb3+的特征荧光峰是由于洛美沙星将吸收的能量传递给Tb3+，从而敏化了Tb3+的发光，与Tb3+水合离子相比较极大地提高了Tb3+的发光强度。由图1C可知，铽离子本身的激发波长在270～290 nm波长之间，为了避免对铽的激发，因此将络合物的激发波长选择为315～330 nm，最终确定为320 nm。综上所述，荧光测定条件确定为1cm石英池，激发波长λex=320nm，发射波长 λem=545nm，狭缝均5 nm。

介质pH确定：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液2.5 mL，Tb3+离子贮备液 1.25 mL，pH 分别为 3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，8.0，9.0，10.0 的缓冲液 2 mL，以水定容，摇匀，依法测定，结果见图2。在pH较低或较高的介质里，Tb3+与洛美沙星很难反应；当介质pH为6.0～6.5时，体系的荧光强度达到最大并且稳定。在碱性条件下，Tb3+易水解，生成铽的氢氧化物沉淀；在强酸时，—COOH难以电离，不易形成络合物。从理论上讲，pH应大于8.0，反应易进行，但会产生沉淀，尤其是磷酸盐缓冲液也会产生TbPO4沉淀。固定pH为6.0，试验了不同缓冲体系醋酸-醋酸钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、Tris-盐酸中Tb3+与洛美沙星的反应情况，发现醋酸-醋酸钠最好，适宜用量在1.5～2.0 mL之间。故本试验选用pH=6.0的醋酸-醋酸钠缓冲溶液2 mL。

Tb3+离子浓度确定：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液 2.5 mL、醋酸 -醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH=6.0）2 mL，分别加入 Tb3+离子贮备液 0 mL（0 倍 ）、0.1 mL（16 倍 ）、0.2 mL（32倍）、0.5 mL（80 倍）、0.8 mL（128 倍）、1.0 mL（160 倍）、1.5 mL（240倍）、2.0 mL（320 倍）、3.0 mL（480 倍）、6.0 mL（960 倍），以水定容，摇匀。依法测定，结果见图3。

图2 LFLX-Tb3+荧光的影响（1.0×10-6～2.0×10-4mol/L）

图3 Tb3+离子浓度对LFLX-Tb3+荧光的影响

洛美沙星-铽离子络合物荧光强度受Tb3+离子浓度影响极大。Tb3+离子浓度增大，有利于配合物的形成，并使络合物体系的荧光强度增大。试验中固定洛美沙星浓度为1.0×10-6mol/L，改变Tb3+离子浓度，发现随着Tb3+离子浓度逐渐增加，在545 nm波长处Tb3+离子的特征荧光强度逐渐增大，同时在435 nm波长处洛美沙星自身的荧光强度逐渐减小。当[Tb3+]/[LFLX]≥200时，体系荧光强度趋于恒定。

2.4 方法学考察

稳定性试验：于25 mL量瓶中依次加入洛美沙星工作溶液1.25 mL、醋酸 -醋酸钠缓冲液（0.1 mol/L，pH=6.0）2 mL、Tb3+离子贮备液 0.65 mL，水定容，摇匀。分别于放置 5，15，25，30，60，120 min时依法测定，结果见图4。可见，最大荧光强度为289.9，最小荧光强度为275.7，最大改变幅度为5.15%，表明络合物的荧光在2 h内稳定。

标准曲线制备：吸取 0，0.025，0.1，0.5，1.0，2.0，3.0 mL 洛美沙星工作溶液，置25 mL量瓶中，加2.0 mL醋酸-醋酸钠缓冲液，加1.25 mL Tb3+离子贮备液，用双蒸水定容，配成浓度为0，1.0×10-8，4.0 ×10-8，2.0 × 10-7，4.0 × 10-7，8.0 × 10-7，1.2 × 10-6，2.4×10-6mol/L的系列溶液，放置30 s，依法测定相对荧光强度。以浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标进行线性回归，回归方程为F=6.448 7 ×108C-5.985 6，r=0.999 9（n=7）。结果表明，洛美沙星浓度在1.0×10-8～2.4×10-6mol/L范围内与荧光强度线性关系良好。检测限为3.5 ng/mL。试验显示，加空白血清对制作标准曲线无干扰。

回收率试验：用标准加入法测定回收率，结果见表1。

表1 胶囊和血样的回收率试验结果（n=6）

2.5 样品测定

洛美沙星胶囊测定：取胶囊10粒（0.1 g/粒），将内容物混匀，取相当于1粒胶囊的药粉，加水少许充分振摇，使药物溶解，过滤除去不溶物，用水洗涤，合并滤液与洗液，置100 mL量瓶中，定容；从中吸取5.0 mL，置50 mL量瓶中，定容；移取0.5 mL于25 mL量瓶中，加Tb3+离子贮备液1.5 mL，0.1 mol/L醋酸-酸酸钠（pH=6.0）缓冲液2 mL，以水定容。依法测定相对荧光强度，结果以百分标示量计。结果3批样品中洛美沙星的百分标示量分别为98.6%，98.9%，99.4%，平均98.98%，均符合国家药品标准WS-203（X-177）-96的规定。

兔血清中洛美沙星测定：取洛美沙星200 mg，加少许0.1 mol/L NaOH溶解，加水10 mL稀释，从兔耳缘静脉注射。分别于给药后0.25，0.75，1.25，1.75，4.0，6.0，8.0，24.0 h 时，从兔耳缘静脉采血 3.0 mL，静置 1 h，离心（4 000 r/min）5 min。取血清 0.5 mL，置另一离心管中，加水 1 mL，乙腈 1 mL，离心（4 000 r/min）5 min。取上清液2 mL，置25 mL量瓶中，加Tb3+离子贮备液1.5 mL，0.1 mol/L醋酸-醋酸钠（pH=6.0）缓冲液2 mL，以水定容。结果见图 5。以logC对时间进行线性回归，计算半衰期（t1/2）为 1.60 h，与文献[16]报道的基本一致，说明本方法可用于洛美沙星的药代动力学研究。

图5 洛美沙星的血药浓度曲线

3 讨论

镧系元素具有在能量转移过程中起重要作用的4f电子。在溶液中，由于游离态镧系离子的摩尔吸收系数ε小，并受水分子光淬灭效应的影响，其发射光很弱。但在加入光敏试剂以后，镧系离子（Ln3+）的发射光大大增强[17]。在溶液中，镧系离子的络合物可吸收有机物（供体）在特征波长处的能量，然后发射出具有镧系离子特征波长的辐射光。本试验利用这一“能量转移”现象，将具有α-酮酸结构的洛美沙星与镧系离子中的铽（Tb3+）结合，吸收外界给予的能量，再以能量转移的形式传给铽（Tb3+），使之发出特征荧光，检测该荧光强度即可测定洛美沙星的含量。

曾考察了pH、Tb3+浓度、乙醇、甲醇、TOPO、β-CD等影响荧光强度的因素，结果表明荧光强度受pH及Tb3+浓度的影响最大，故选择中性条件下，[Tb3+]/[LFLX]=200测定洛美沙星。

喹诺酮类药物的结构特点决定了其具有良好的紫外吸收和荧光性质，因此光谱法广泛适用于此类药物的分析测定。本试验建立的分析方法背景干扰小、专属性和灵敏度高，样品仅做简单的预处理，可直接应用于洛美沙星血样、动力学研究和胶囊质量分析。

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