猪传染性胸膜肺炎的诊断技术

谢芳，张艳禾，司微，刘思国，王春来

（中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，兽医生物技术国家重点实验室动物细菌病研究室， 黑龙江哈尔滨 150001）

猪传染性胸膜肺炎（PCP），是一种高度传染性、致死性的呼吸系统传染病。该病的主要特征是急性与亚急性病例呈现纤维素性出血性胸膜肺炎、慢性病例呈现纤维素性坏死性胸膜肺炎。1957年，英国人Pattison等首次发现该病，目前已在世界各国广泛流行，造成巨大的经济损失，严重阻碍了世界养猪业的健康发展，成为国际公认的危害现代化养猪业的重要传染病之一。随着现代养殖业规模化、集约化的发展，本病的发生呈暴发趋势，并且近年来该病常与其它呼吸系统疾病继发感染或混合感染，如该病与猪蓝耳病、猪伪狂犬病、猪支原体肺炎、猪肺疫、副猪嗜血杆菌病等混合感染，加重了其危害性。目前，该病引起了国内外研究者的广泛关注，是猪细菌性传染病研究的热点之一。1987年，哈尔滨兽医研究所首次在我国报道该病，此后在许多省市陆续发现该病。2006年，对洛阳地区规模化猪场进行血清学调查，阳性率为30.39%，2009年，对四川部分地区的1062份非免疫猪血清进行检测，平均阳性率为18.5%。

一、病原学

该病的致病菌是胸膜肺炎放线杆菌（APP），最初被称为副溶血嗜血杆菌或胸膜肺炎嗜血杆菌。1953年，Pohl等通过DNA杂交试验表明，该菌与林氏放线杆菌关系密切，因此将其划归于巴氏杆菌科，放线杆菌属，并命名为胸膜肺炎放线杆菌。

（一）生物学特性 APP为革兰氏阴性球杆菌，具有多形态，常呈小杆菌或球杆菌。兼性厌氧，具有荚膜和纤毛，不形成芽孢。近年来研究发现该菌有鞭毛，具有运动性，长约3μm，宽约0.5μm 。

APP的培养特性：该菌生长的最适温度为37℃，最佳pH值为7.6～7.8，供给5%～10%CO2会促进其生长发育。该菌营养要求较高，在普通琼脂平板不生长，最适生长的培养基为巧克力琼脂平板、绵羊血琼脂平板及马血清肉汤平板等。该菌对外界环境条件抵抗力不强，不能在外界环境中持续存在，60℃加热15 min即死亡，对日光、干燥和一般化学消毒剂抵抗力低，1%漂白粉、1:100百毒杀都可在2 min使其灭活。但对结晶紫、杆菌肽、壮观霉素和林肯霉素等有一定的抵抗力。

APP的形态特征：该菌在绵羊鲜血琼脂平板上37℃培养24 h后，菌落呈圆型、针尖大小、边缘整齐、中间稍凸，呈β溶血；以同样条件在巧克力琼脂平板上培养，菌落形态会稍大。在绵羊鲜血琼脂平板上培养时，金黄色葡萄球菌的划线两侧，能够加重溶血区，称为“cAMP”现象。将1%NAD液交叉划线于马血清肉汤琼脂平板上，37℃培养18 h后，画线近端处的菌落生长旺盛，远端生长较少，称为“卫星”现象，此为该菌生物Ⅰ型的典型特征。生物Ⅱ型不需要NAD就可生长，其它特征同生物Ⅰ型。

（二）血清分型 根据APP的生长是否需要烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD，又称V因子），可将APP分为生物I型和生物Ⅱ型。生物I型生长需要NAD，生物Ⅱ型生长可不需要NAD，但需要其它特定的吡啶核苷酸或其前体以合成NAD。

根据APP表面荚膜（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性的不同，可将APP分为15个血清型，血清1型又分为1a和1b两个亚型，血清5型又分为5a和5b两个亚型；血清型1～12、15属于生物I型，血清型13、14属于生物Ⅱ型。此外，还有一些分离到的APP依据现在的分类系统还不能划分其血清型。

APP的15种血清型都能致病，但毒力存在明显差异，其中血清型1、5、9和11被认为毒力最强，常见于急性暴发、高死亡率和肺脏出现严重病变；其它血清型的毒力较弱，被认为毒力最低的是血清3型和6型。

APP不同血清型的免疫原性也存在很大的差别，血清型间不存在交叉保护，针对某一血清型的灭活苗无法对APP其它血清型提供保护。然而有些血清型的菌株之间有相似的膜蛋白或脂多糖成分，引起了血清学交叉反应，给该病的分型诊断造成了一定的困难，如在血清型l与7之间，l、9及11之间，3、6及8之间，4与7之间。

二、流行病学

该病分布广泛，流行于世界各国。各个国家和地区流行的血清型不同，如欧洲流行的血清型主要为1、2、5、7和9型；美国流行的血清型主要为l、5和7型；加拿大流行的血清型主要为1、3和5型；日本流行的血清型主要为5、6和7型；我国流行的血清型主要为1、3、5和7型。随着各国之间引进种猪的不断增多，血清型也更复杂。一些国家或地区可能同时流行多个血清型，甚至同一猪场内还可能存在不同血清型。存在于我国的APP血清型非常多，目前已发现并分离到血清型1、2、3、4、5、7、8和15等多种血清型。

该病于气候骤变时多发，如冬末春初或夏末秋初；夏季也时有发生。饲养条件差可诱发该病，如饲养密度过高、圈舍潮湿、通风不良、尘埃多等不良因素。各种年龄的猪均对APP易感，3～4月龄猪多发，成年种公母猪也有散发。

该病主要由空气传播、接触病猪及其污染物传播，引进带菌猪或慢性感染猪是其最主要的传播途径，从而造成未感染该病的猪群发病。1988年，朱士盛等对10个省份的296头进口猪进行血清学调查，发现阳性率为26.7%，表明该病在我国的发生与引种有密切关系。

近年来，该病常与猪蓝耳病、猪支原体肺炎、猪伪狂犬病、猪肺疫、猪瘟、副猪嗜血杆菌病等混合感染，导致病情加重，死亡率升高。一般来说，该病受气候环境、饲养条件的影响，发病率和死亡率差异很大，分别在8.5%～100%和0.4%～100%。

三、临床症状和病理变化

APP随气流进入呼吸道，在肺泡内定居、增殖并产生毒素，导致纤维素性出血性胸膜肺炎。患病猪的主要病变在胸腔内，典型特征是呈现纤维素性、出血性和坏死性肺炎。

最急性病例临床表现为突然发病，体温高达41℃，沉郁，食欲不振，并出现呕吐和腹泻，卧地不起，呼吸困难，张口呼吸，口鼻腔流出泡沫样液体，呈红色，多于24～36 h内死亡。病理变化：肺部呈红色肿胀，表面出现出血点，呈粟粒大小；肺切面多汁，流出红色液体，气管腔内充满泡沫样红色液体。有些病例肺小叶间质明显增宽。

急性病例临床表现为体温高达41℃～42℃，呈稽留热，精神高度萎靡，食欲渐少乃至废绝。呈现出不同程度的呼吸困难，表现为呼吸加快、张口呼吸呈犬坐式，且伴有咳嗽和呻吟。黏膜呈现潮红或紫红色，鼻腔流出浆液或粘液性棕红色鼻液。耳鼻、四肢、腹下等处淤血。多数病猪于2～3 d内窒息死亡。少数病猪出现腹泻和呕吐症状。部分病猪如果及时治疗可以转归痊愈。病理变化：胸腔内出现大量积液，呈黄色或红黄色。肺叶肿大，肺膜增厚、粗糙，多数病例肺叶出现大小不一的斑块，呈紫红色，严重病例肺脏呈紫红色病变，质地坚实，有些病例肺叶部分区域出现大理石状条纹，呈紫红色、灰红色和灰白色相间，质硬如肝。

亚急性和慢性病例多是由于急性病例治疗不当转化而来所造成的，临床表现为食欲减退、消瘦、间歇性咳嗽，易继发感染其它病原而使症状加重甚至导致死亡。某些病例母猪流产、关节炎，并且猪体不同部位出现脓肿。病理变化：肺脏呈现大小不等、由结缔组织包裹的坏死性结节。结节处胸壁和肺脏粘连，切开会流出灰白色脓样物。严重病例心包、心外膜、胸膜、肺以及膈肌等多处广泛粘连。有时还伴有全身广泛性淤血和出血、出血性淋巴结炎和急性脾炎等变化。

四、诊断

对APP的诊断与检测主要是通过病原学、血清学或分子生物学的方法。

（一）病原学诊断方法 传统的病原学诊断方法主要是对APP分离与鉴定。一般是从病猪的鼻腔、支气管、肺脏病变组织处或胸水等处进行分离。所用培养基需要营养丰富，一般该菌可在巧克力琼脂平板或绵羊血琼脂平板上分离出。经形态染色、生化试验、呈现“cAMP”及“卫星”现象、溶解绵羊血、尿素酶试验阳性，可鉴定为APP生物Ⅰ型菌株，如果生长时还不需要NAD，可鉴定为生物Ⅱ型菌株。可同时结合协同凝集试验或琼脂扩散试验等血清学诊断方法做确诊，或是结合PCR等分子生物学诊断方法做确诊。

此外，免疫磁珠法是一种新出现的APP分离方法。1998年，Gagne等用免疫磁珠法从感染血清1型的猪体中分离到APP，该方法是先用特异性多克隆抗体或单克隆抗体包被磁珠，再将磁珠与病料相互作用，在磁场作用下分离出该菌。2001年，Angen等也用免疫磁珠法从血清2型感染猪体中分离到APP。相对于传统的细菌分离方法，免疫磁珠法更准确和简便，并且比PCR方法更灵敏，但对仪器设备要求较高，因此不适于基层广泛应用。

（二）血清学诊断方法 APP的血清学诊断方法主要有补体结合试验、间接血凝试验、协同凝集试验、乳胶凝集试验、琼脂扩散试验和酶联免疫吸附试验等。

1.补体结合试验（CFT）是由Nicolet于1971年首次将其用于检测APP并迅速成为APP分型的最早标准方法。CFT的敏感性和特异性较好，检出率可达100%，感染APP两周后就可检出抗体，因此多年来被用于APP的检测，并且该方法能够区分与APP亲缘关系较近的细菌，如副猪嗜血杆菌等。但CFT操作繁琐、费时费力，所以一般只在实验室中使用。

2.间接血凝试验（IHA）是由Mittal于1983年建立并将其用于APP检测和分型。1990年，Mittal等发现凝集试验和COA不能区分血清1型和9型，而IHA却能区分二者。

3.协同凝集试验（COA）是一种简单快速的APP检测和分型的方法。1988年，Mittal等 将2-疏 基乙醇试管凝集、COA和琼脂糖扩散试验结合并用于APP检测，可以区分血清6型与其它血清型。1991年，Mittal等发现需要结合应用COA和琼脂扩散试验以区分血清4型和7型。相比于IHA和琼脂扩散试验，COA简单、快速，特异性较高，适于临床推广应用。

4.乳胶凝集试验（LAT）是一种快速简捷的APP检测和定型方法。1992年，Inzana等首次将LAT引入到APP的检测中，并发现LAT能区分血清l型和9型。1995年，Inzana提出一种改进的乳胶凝集试验方法，该方法灵敏度高、特异性好，不与多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌和猪放线杆菌交叉反应，并且该方法不需要大量仪器设备，非常适于快速临床检测，具有良好的应用前景。

5.琼脂扩散试验又称免疫扩散试验，能辅助其它试验区分交叉反应的APP血清型，如协同凝集试验或2-疏基乙醇试管凝集等。但琼脂扩散试验的敏感性和特异性都不如ELISA。

6.酶联免疫吸附试验（ELISA）是近年来检测APP的最常用的血清学诊断方法。1981年，Nicolet等首次用ELISA试验对APP进行分型。1992年，Trottier等制定了一个鉴别APP血清5型的ELISA试验的标准草案。目前，ELISA已经成为检测APP的主要方法之一。

（三）分子生物学诊断方法 PCR技术是用于检测APP的主要分子生物学诊断方法。由于PCR技术的快速、简便、灵敏性高、特异性好和无交叉反应等优点，使得近年来PCR方法成为国内外检测APP的最主要的方法。目前，国内外己经建立了多种PCR检测方法用于猪传染性胸膜肺炎的早期诊断和APP的快速鉴定。1995年，Frey等建立了基于Apx的PCR检测方法，并能将所有APP血清型区分为4种Apx类型，不仅提高了APP检测率和流行病学调查的效率，还有助于发现非典型的溶血素分子结构。1995年，Gram和Ahrens建立了基于omlA基因的PCR检测方法，具有较高的种特异性和敏感性。2001年，Schaller等建立了基于apxⅣA基因的PCR检测方法，特异性和敏感性均很高。2009年，Yang等针对apx Ⅳ 基因建立了检测APP的环介导等温扩增技术，比巢氏PCR敏感十倍，认为是高敏感性和特异性的检测方法。

此外，PCR方法还可以通过血清型特异的引物起到区分血清型的作用。一直以来，国内外很多学者都在研究和改进APP的PCR分型系统。2000年，de la Puente-Redondo等建立了基于tbpA和tbpB基因的PCR-RFLF诊断与分型方法，具有较高的种特异性和敏感性，能同时将所有APP血清型分为10个RFLP类型，但无法区分血清型4和11、血清型7和9。2000年，Gram等建立了基于溶血素和omlA基因的PCR诊断与分型方法，能区分大多数APP血清型，但不能区分血清型1和9、血清型2、8和11。此后，研究者还建立了多种多重PCR方法能同时分型检测几种不同的血清型，并能区分具有血清交叉反应的血清型，如血清型2、5和6，血清型1、2和8，血清型1、7和12，血清型3、6和8，血清型1、2和5。

此外，还有许多正在处于研究阶段的新方法，如抗APP单克隆抗体的制备、APP胶体金诊断试纸条的研制、基因芯片检测方法，这些方法既方便又快捷，可用于大规模的APP检测，既能确定种又能分型鉴定，有良好的应用前景。

（略）