特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞过度表达单核细胞趋化蛋白-1

邓小玲 陈耿臻 许铭炎

特发性肺纤维化病人肺成纤维细胞过度表达单核细胞趋化蛋白-1

邓小玲 陈耿臻 许铭炎

目的 研究凝血酶对正常人肺成纤维细胞(normal human lung fibroblasts,N-LF)和特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)病人肺成纤维细胞(F-LF)单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)表达的影响。方法 N-LF和F-LF细胞分别培养于96孔培养板内，凝血酶诱导4和24h后， 收集上清液并用ELISA方法检测MCP-1蛋白水平。结果 凝血酶可诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1，但F-LF细胞的MCP-1分泌水平远远高于N-LF细胞。 结论 人肺成纤维细胞在肺纤维化过程中过度合成和释放MCP-1，凝血酶可进一步促进其过度表达MCP-1。

凝血酶；单核细胞趋化蛋白-1；正常人肺成纤维细胞；肺纤维化病人肺成纤维细胞

肺纤维化是由于过多的成纤维细胞聚集和细胞外的基质成分如胶原蛋白沉积而导致正常的肺组织结构改变和功能丧失的一种疾病，是多种慢性肺疾病的常见结局，包括特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)[1]。细胞因子如单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)在介导肺炎症及纤维增生起关键作用：一方面通过募集和活化单核细胞，参与肺纤维化进程中的炎症和纤维化应答；另一方面，通过促进成纤维细胞增生、分泌胶原及产生促纤维化细胞因子TGF-β参与胞外基质沉积及正常肺结构的改变[2-3]。

在急、慢性肺损伤的动物模型及肺纤维化病人的支气管灌洗液中活性凝血酶的量显著性增加，提示过度的凝血级联反应可促进肺损伤及纤维化的病理生理进程[1-4]。凝血酶可诱导多种细胞分泌MCP-1，如上皮细胞[5]和人胚肺成纤维细胞[6]，但凝血酶是否可在肺纤维化时诱导MCP-1高表达还尚不清楚。本研究以正常人肺成纤维细胞(normal lung fibroblasts, N-LF)和IPF病人肺成纤维细胞(F-LF)为实验对象，比较凝血酶对其MCP-1表达的调节作用。

1 材料与方法

1.1 材料 人凝血酶购于Sigma公司(美国)，DMEM培养液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶消化液均购自于Gibco公司(美国)，人MCP-1 ELISA检测试剂盒购于R&D公司(美国)，N-LF和F-LF均获赠于英国诺丁汉大学肺呼吸研究中心。

1.2 方法

细胞培养 细胞接种于50mL培养瓶内，用DMEM完全培养液(含100mL/LFBS、100mg/L青/链霉素)，于37℃，50mL/LCO2培养箱中培养。等细胞铺满瓶底后，用2.5g/L胰蛋白酶-EDTA消化，将获得的细胞分种于96孔培养板内，用100μL培养液培养24h后，换无血清培养液培养24h。实验时，对照组内加入无血清的DMEM完全培养液，其它组每孔细胞内加入凝血酶(10nmol/L)，培养4和24h后收取细胞上清液并用人MCP-1 ELISA 检测试剂盒检测MCP-1水平(详见说明书)。每组实验均使用3孔细胞并重复3次。

2 结果

凝血酶诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1

结果显示，凝血酶可显著诱导N-LF和F-LF细胞呈时间相关性释放MCP-1(P均＜0.05)，其中凝血酶刺激4和24h后N-LF细胞MCP-1的分泌水平分别是其相应对照组的2.6和69倍(图1A)，而F-LF细胞MCP-1的分泌水平分别是其相应对照组的7和154倍(图1B)。进一步比较两组细胞MCP-1的分泌水平，结果显示凝血酶刺激4和24 h后，F-LF细胞分泌的MCP-1均高于N-LF细胞(图1C，P均＜0.05)。

3 讨论

实验证明敲除MCP-1或其主要受体CCR2均可保护由博莱霉素诱导的肺纤维化[7-8]。核酸原位杂交及免疫组化结果证实MCP-1在肺纤维化病人及博莱霉素诱导的肺纤维化鼠肺组织中过度表达[9-10]。临床研究发现，血清中MCP-1分泌水平可作为生物标记用来衡量用皮质类固醇治疗肺纤维化病人的治疗效果[11]。因此，MCP-1在肺纤维化过程中炎症修复及纤维增生中的作用日益得到关注和重视。

体内实验结果发现敲除凝血酶受体后MCP-1的表达下调，而且凝血酶受体敲除可保护由博莱霉素诱导的肺纤维化，这间接说明MCP-1的高表达可加重肺纤维化[12]，但具体机制还不清楚。本实验结果第一次报道了凝血酶可诱导原代培养的正常人肺成纤维细胞及IPF病人肺成纤维细胞释放MCP-1。结果显示在基础条件下F-LF细胞MCP-1分泌水平高于N-LF，虽无统计学差异但说明在肺纤维化时成纤维细胞有过度释放MCP-1的趋势。本次实验结果还显示凝血酶均可诱导两种细胞呈时间相关性释放MCP-1，其中IPF病人肺成纤维细胞在所检测的时间段释放的MCP-1均远远高于正常人肺成纤维细胞，这说明在肺纤维化过程中凝血酶可诱导肺成纤维细胞过度释放MCP-1。

图1 凝血酶诱导N-LF和F-LF细胞释放MCP-1

综上所述，我们的结果表明在肺纤维化过程中，肺成纤维细胞有过度表达MCP-1的趋势，凝血酶可持续高效地诱导肺成纤维细胞释放MCP-1，但其具体机制还需进一步实验证明。

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Objective To investigate the effects of thrombin on monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1)protein release and mRNA expression in both normal human lung fi broblasts (N-LF)and fi broblasts derived from IPF (idiopathic pulmonary fi brosis patient)(F-LF). Methods N-LF and F-LF were cultured in a 96-well culture plate. Cells were stimulated with thrombin (10 nmol/L)for 4 and 24 h. Culture supernatants from 96-well plates were collected and MCP-1 protein levels in supernatants were assessed by ELISA. Results Thrombin can induce N-LF and F-LF MCP-1 release, and the MCP-1 levels in F-LF are much higher than the MCP-1 levels in N-LF. Conclusion Fibroblasts MCP-1 mRNA derived from patients with IPF overexpress MCP-1 and thrombin can induce its MCP-1 expression with high eff i ciency.

Thrombin; Monocyte chemoattractant protein-1; Normal human lung fi broblasts; Fibrotic lung fi broblasts

10.3969/j.issn.1009-4393.2010.19.065

515041 汕头大学医学院细胞生物与遗传教研室 (邓小玲)汕大医学院第二附属医院外科 (陈耿臻 许铭炎)