雌激素相关受体alpha特性抑制剂XCT-790对细胞糖代谢的影响

杨冰 王海彬 梁笃 王军舰 方芳 高明慧 刘文明 周曦

雌激素相关受体被认为主要通过与过氧化物酶体增殖物受体α共激活因子PGC-1α、PGC-1β相互作用，共同调控氧化磷酸化通路上的基因的转录，从而调控能量代谢的平衡。除了参与调控能量代谢外，ERRα还被认为是乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、以及前列腺癌等多种癌症的诊断靶标[1-5]。研究显示抑制ERRα活性或者降低其表达可以有效地抑制多种癌细胞的增殖[6-8]。但在癌细胞中，ERRα对糖代谢的调控尚不明确。本研究将有利于我们深入了解ERRα对癌细胞能量代谢的调控。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

人肺腺癌A 549细胞系购自美国典型培养物保藏中心(A TCC)。培养于含10%胎牛血清、100U/m L青霉素和100μg/m L链霉素的RPM I1640培养液、RPM I1640培养液中，37℃，5%CO2潮湿二氧化碳培养箱中培养。所用细胞都处于对数生长期，根据ATCC网站提供的方法步骤进行培养。

1.2 试剂

DM EM培养基购于Gib co公司，胎牛血清购于H y clone公司，TRizo l和SuperScrip tTM Ⅲ RT逆转录试剂盒购于Inv itrogen公司，5-3H-g lucose和2-deox y-D-[2,6-3H]glucose购自北京原子高科，SYBR RT-PCR定量PCR试剂盒购自Takara公司。其余常用试剂均为国产分析纯。

1.3 糖酵解

A549细胞以80000每孔传代于24孔细胞培养板中培养过夜，之后加入不同浓度的XCT-790继续培养24h，糖酵解根据以前的报道通过测定5-3H-glucose向3H2O的转变进行[9]。简述如下：K reb缓冲液(100μl)孵浴A549细胞0.5h，每孔加入10μL5-3H-glucose继续在37℃5%CO2温湿培养箱培养1h。每孔加入50μL0.2mol/LHCl终止反应, 将100μL反应液加入到开盖的0.5m l离心管中，将离心管树立与一个含有0.5m lH2O的4m l闪烁管中密封，室温放置2d。闪烁液加入到原来的diffused counts和第2个undiffused counts管中。弥漫(diffused)和非弥漫(undiffused)的3H进行闪烁检测，糖酵解效率以细胞数量进行校正。

1.4 糖吸收

A 549细胞以80000每孔传代于24孔细胞培养板中培养过夜，之后加入不同浓度的XCT-790继续培养24h。PBS洗涤2次，FCB溶液(K reb’s R inger with 2mm ol/L py ruvate and 2% BSA)37℃孵浴35m in。加入2-deoxy-D-[2,6-3H]g lucose(8.3μCi/m L)继续培养10m in，冰冷的PBS洗涤2次，同位素闪烁活性通过加入闪烁液进行检测。糖吸收以细胞数量进行校正。

1.5 实时定量PCR

将细胞以2×105每孔传代于6孔板中，培养过夜。加入XCT-790继续作用24h，采用Trizol提取细胞总RNA，SuperScriptTMⅢ RT逆转录试剂盒将总RNA逆转产生cDNA，保存于-20度冰箱。设计基因特异引物，采用实时定量PCR技术检测基因表达，以18S rRNA作为内源对照。

2 结果

2.1 XCT-790对细胞糖酵解的影响

先前的研究证实，ERR特异性抑制剂XCT-790可以显著的增加肺癌A 549细胞的三羧酸循环，三羧酸循环的提高将增加葡萄糖的利用[7]。在本研究中，首先采用同位素示踪技术检测XCT-790对细胞糖酵解效率的影响。结果显示XCT-790可以显著地增加肺癌A 549细胞糖酵解效率(图1)。

2.2 XCT-790对细胞糖吸收的影响

糖酵解效率的提高意味着细胞对葡萄糖利用的增加，因此细胞需要吸收更多的葡萄糖以满足细胞的糖代谢。采用同位素示踪技术研究XCT-790对肺癌A 549细胞糖吸收的影响，发现XCT-790可以显著地增加肺癌A 549细胞糖吸收(图2)。

2.3 XCT-790对细胞糖代谢相关基因表达的影响

图1 XCT-790显著地增加肺癌A 549细胞糖酵解效率 *P＜0.01，**P＜0.01。

图2 XCT-790显著地增加肺癌A 549细胞糖吸收 *P＜0.01，**P＜0.01。

图3 XCT-790显著地增加Tigar基因表达**P＜0.01。

最新的研究显示，抑癌蛋白p53可以通过调控其下游基因Tigar基因的表达调控细胞的糖代谢[10]。先前的研究已经证实XCT-790可以显著的增加p53蛋白的表达[11]。在本研究中，采用定量PCR进一步证实XCT-790可以显著地增加Tigar基因表达(图3)。

3 讨论

ERRα与共激活因子PGC-1s能够通过协同调控下游靶基因表达影响线粒体的生成，并通过MCAD等直接刺激细胞的脂肪酸氧化促进细胞的脂肪酸利用，因而研究者们起初认为ERRα的激活剂能够起到促进脂肪酸利用、增加肌肉细胞胰岛素敏感性，以达到预防和治疗糖尿病的目的。与之相矛盾的是，ERRα基因敲除小鼠能够抵抗高脂饲料引起的肥胖，而且ERRα可以促进三羧酸循环抑制蛋白丙酮酸脱氢酶激酶(PDK)的表达，从而抑制糖酵解和糖吸收，因而ERRα的抑制剂也可能有利于代谢性疾病的治疗。我们先前的研究也证实抑制ERRα活性可以有效地增加细胞三羧酸循环，在本研究中进一步证实ERRα的特异性抑制剂XCT-790可以显著提高癌细胞的糖酵解和糖吸收能力。除了在能量代谢中的重要作用，ERRα现在又被发现是多种癌症的治疗靶标，但其分子机理作用尚不清楚。癌症与能量代谢的关系以及ERRα在两者之间的作用尚需要进一步的研究。值得注意的是，抑癌蛋白p53可以通过增加其靶基因Tigar的表达调控细胞的糖代谢，而我们先前的研究证实XCT-790可以显著地增加p53蛋白表达。在本研究中XCT-790可以显著地增加Tigar基因的表达。因此Tigar可能在ERRa调控能量代谢和癌细胞增殖中起到一定的作用。因此我们的研究提供了关于一个能量代谢和癌症发生之间的联系，通过能量代谢的调控可能是一个有效的治疗癌症的途径。

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