胃癌常见中医证型与CDX2、LN-R和MMP-9阳性表达的相关性研究

田君才 张莉 焦丹 戴伟平 李昌吉 张桂霞

胃癌在我国恶性肿瘤死因顺位中位居第一位，占全部肿瘤死亡总数的四分之一。浸润和转移是恶性肿瘤致死的主要原因，因此恶性肿瘤的浸润与转移成为肿瘤学研究的热点和难点之一。基质金属蛋白酶(MMPs)是一系列生理情况下可降解细胞外基质及基底膜的内肽酶总称，其中明胶酶(MMP-9)可分解基底膜Ⅳ型胶原，作为专一性降基膜的酶越来越引起关注。层粘连蛋白(LM)是一种基底膜糖蛋白，通过与受体(LM-R)结合能调节细胞的粘附、扩散和迁徙。恶性肿瘤细胞表面含有大量LM-R，使瘤细胞更易与基底膜粘附，在肿瘤的浸润、转移过程中起重要作用。尾侧同源框相关基因2(CDX 2)抗体在人体组织中有明显的肠道特异性，在结肠、直肠为主的的消化道及相关肿瘤中高度表达，低表达在其他肠道，但胃中无表达。

1 临床资料

1.1 一般资料 收集酒泉市人民医院病理科(2002～2003年行手术治疗)胃癌病例，详细翻阅病历档案，依据1978年全国第一届胃癌学术会议北京市胃癌协作组制定的6型分法对患者进行中医辨证分型，选取其中符合瘀毒内阻型、肝胃不和型和脾胃虚寒型的三种证型共53例，全部获病理学确诊。观察其病理组织形态特点(男41例，占选取胃癌病例的77.4%，女12例，占选取胃癌病例的22.6%，平均年龄(57.2±8.5)岁，男：女=3.4：1)，Laurén分型：肠型29例，弥漫型24例。TNM分期：Ⅰ期11例，Ⅱ期11例，Ⅲ期22例，Ⅳ期9例。按细胞分化程度：高分化14例，中分化20例，低分化15例。无淋巴结转移17例，有转移36例，选取其中蜡块保存较好的胃癌手术切除标本行免疫组织化学检测。所有标本4μm连续切片，分别作HE染色和免疫组织化学染色。

1.2 实验步骤及方法 查阅病例档案，统计并收集病例，选取病例，辨证分型，4um连续切片，HE染色，进行W HO和Lau ren分型，免疫组化染色，观察分析实验结果，采用SPSS13.0统计软件进行统计学处理。

1.3 实验步骤 所有标本按照常规病理技术处理，10%的福尔马林固定，石蜡包埋，4um石蜡切片，常规HE染色，观察胃粘膜的组织病理形态。

1.4 免疫组织化学染色 用EliVision法，观察CDX 2、MMP-9和LM-R蛋白在胃癌中的表达情况。

2 结果

2.1 结果判断 阴性对照实验用PBS代替一抗，余同，以此结果为阴性对照。阳性对照采用迈新生物提供的阳性对照片作为阳性对照。其中CDX 2阳性染色主要定位于细胞核，呈棕黄色颗粒，也有部分位于细胞浆；MMP-9阳性表达部位主要位于胞浆，呈棕黄色或棕褐色颗粒；LM-R阳性表达部位主要位于细胞膜，少数细胞质也有表达，呈黄色颗粒。见图1～3。

2.2 统计学处理 所有数据均采用SPSS13.0软件应用x2test，2-sided Fisher’s test，Spearm an’s rank correlation，配对的癌组织、癌旁组织采用Coch ran’s Q test。其中P＜0.05为差异有统计学意义。

3 研究结果

3.1 在肝胃不和、瘀毒内阻、脾胃虚寒三种证型胃癌中CDX2、LM-R及MMP-9的表达情况分别见表1～表3。

经x2检验结果显示CDX2在此三种不同的中医证型中的表达无明显差异性(P值均＞0.05)。

LM-R在肝胃不和型中的表达明显高于瘀毒内阻型(P＜0.05)，在肝胃不和型中的表达明显高于在脾胃虚寒型中的表达(P＜0.05)，而在瘀毒内阻型与脾胃虚寒型中的表达没有显著差异(P＞0.05)。

表1 胃癌中医证型与CDX 2表达[n(%)]

表2 胃癌中医证型与LM-R表达[n(%)]

表3 胃癌中医证型与MMP-9表达[n(%)]

表4 CDX 2、LM-R和MMP-9蛋白之间表达的免疫组化结果

图1 MMP-9阳性×400 图2 CDX 2阳性×400

图3 LM-R阳性×400

MM P-9在肝胃不和型中的表达明显高于瘀毒内阻型(P=0.001＜0.05)，在脾胃虚寒型中的表达明显高于瘀毒内阻型(P=0.002＜0.05)，而在肝胃不和型与脾胃虚寒型中的表达没有显著差异(P=1＞0.05)。

3.2 CDX 2、LM-R和MMP-9蛋白之间表达的免疫组化结果 经Pearson相关分析、x2检验，CDX 2表达与LM-R或者MMP-9表达水平之间无相关性(P＞0.05)；LM-R与MMP-9表达水平之间呈现显著相关性(P＜0.05)。

4 结论

4.1 CDX 2、LM-R和MMP-9三者在胃癌及其配对正常癌旁组织中的阳性表达率均存在显著差异，表明以上三种基因阳性表达与胃癌发生相关。

4.2 MMP-9在TNM分期中Ⅰ、Ⅱ期中的阳性表达率明显低于Ⅲ、Ⅳ期中的阳性表达率。LM-R在TNM分期中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期中的阳性表达率明显低于Ⅳ期中的阳性表达率。

4.3 MM P-9与LM-R在胃癌组织中的阳性表达率呈现明显正相关；而CDX 2与LM-R及MMP-9之间无相关性。

4.4 CDX 2在肝胃不和、瘀毒内阻和脾胃虚寒三种证型胃癌中的表达无明显差异性；LM-R和MM P-9在不同证型的胃癌的表达均有显著差异，可作为胃癌辨证分型的辅助参考指标。

5 讨论

传统医学结合现代医学共同发展是当前中医学产生突破的一个方向。王氏等分析总结胃癌中医辨证，认为中医证型确有其病理学基础，它反映了胃癌的不同时期及不同程度，同时也给判断病情，推测预后，指导治疗(包括外科手术治疗)提供了必要的理论依据[1]。郭氏研究慢性胃炎、消化性溃疡、食管癌、胃癌1000例辨证分型与胃镜图像关系进行了探讨，认为根据中医辨证，结合胃镜图像检查，可将上述疾病分为：肝胃气滞、气滞血瘀、脾胃虚寒、湿热中阻、寒热错杂五型，可能为中西医结合诊治消化系统疾病提供了较为规范化的客观依据[2]。周冬枝等[3]从基因及蛋白表达不同角度着手，用半定量方法研究表明：随着脾虚症状积分升高，p53，Bcl-2蛋白表达水平呈递增趋势，脾虚症状积分与p53，Bcl-2蛋白表达水平分别呈正相关，而Bcl-2蛋白的表达水平随着脾虚症状积分升高有递减趋势。说明脾虚证的发生发展与p53，Bcl-2蛋白表达升高有关，进一步证明基因表达与证的物质基础有关，p53，Bcl-2基因是胃癌脾虚证的相关基因。

本课题研究发现：MMP-9在3种证型中的表达为脾胃虚寒型＞肝胃不和型＞瘀毒内阻型，其中脾胃虚寒型、肝胃不和型与瘀毒内阻型有显著性差异(P＜0.05)；LM-R在3种证型中的表达为肝胃不和型＞脾胃虚寒型＞瘀毒内阻型，其中肝胃不和型与瘀毒内阻型、脾胃虚寒型均有显著性差异(P＜0.05)；CDX 2在3种证型中的表达为脾胃虚寒型＞肝胃不和型＞瘀毒内阻型，各证型间无显著性差异，但已有组间差异的趋势。由于各目的基因在转移的不同步骤发挥作用，结合实验结果，提示同一基因在不同证型中发挥的作用不同，不同证型的转移机制存在着一定的差异。而肝胃不和型中各基因的表达为MM P-9＞LM-R＞CDX 2；脾胃虚寒型中各基因的表达为MM P-9＞CDX 2＞LM-R；瘀毒内阻型中各基因的表达为CDX 2＞MMP-9＞LM-R；不同证型3种基因的表达情况既有相同之处，又存在一定差异。提示我们：目的基因在m RNA水平表达的差异可能是形成不同证型的内在物质基础之一。

[1]王安峰,刘斌,赵玉华,等.中晚期胃癌中医辨证分型与组织病理学分型的关系及疗效观察[J].中国中西医结合外科杂志,2000,6(3):165.

[2]郭森仁,黄皓春,陈峻伟.胃镜像与常见上消化道疾病辨证关系初探[J].北京中医,1994(5):16.

[3]周冬枝,昊苏冬,刘永惠,等.胃癌中医证型与p53,bc1-2,bax基因蛋白表达关系的研究[J].北京中医药大学学报,2003,26(2):26.