新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究

廖海艳,周卫国,王方剑

(1.湖南省第一师范学院,湖南长沙 410205;2.湖南省永州零陵区畜牧水产局动物防疫监督站,湖南永州 425006)

新生小鼠卵巢组织玻璃化冷冻保存与异体异位移植研究

廖海艳1,周卫国2,王方剑1

(1.湖南省第一师范学院,湖南长沙 410205;2.湖南省永州零陵区畜牧水产局动物防疫监督站,湖南永州 425006)

开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础。采用微滴法玻璃化冻存方法处理卵巢,卵巢复苏后移植到昆明系雄性小鼠受体肾囊下,19只雄性受体鼠接受了卵巢移植,每侧肾囊移植2枚,卵巢共移植1日龄小鼠卵巢38个。饲喂28 d有效回收移植卵巢的受体鼠为17只,受体总有效率分别为89.4%;有效回收移植卵巢30个,卵巢总回收率为78.9%。结果表明,小鼠早期卵巢经过冷冻、解冻并异体异位移植后,其原始卵泡能够重新启动生长发育。

小鼠;玻璃化冷冻保存;卵巢移植

卵巢移植起源于19世纪末期,最初用于治疗绝经期妇女和双侧卵巢切除而产生的不良反应。到1935年,由于自体移植效果不理想,而异体移植效果更差,使得这一技术被长期搁置。在近10年中,经过不断的摸索,卵巢冷冻保存后进行移植在不同的动物都取得一定的成果[1]。如用从狨和小鼠卵巢组织移植到雌性受体中获得的卵母细胞已经完成了受精及胚胎分割。本研究将利用玻璃化冷冻方法开展小鼠新生胎儿卵巢组织冷冻保存与移植研究,为建立家畜卵巢组织冷冻保存与移植技术奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 昆明小鼠(KM Mice)购自湖南中医学院实验动物中心,自繁1日龄(出生当天为第1天)雌鼠作为卵巢供体,7周龄～12周龄雄鼠作为卵巢移植受体。试验小鼠在自然光照、22℃～25℃环境温度条件下饲养,自由饮食、采食。

1.1.2 主要试剂

Leibovitz 15(L-15)培养基购自Invitrogen公司;新生牛血清(NBS)购自北京鼎国生物科技有限公司;乙二醇(EG)购自国药集团化学试剂有限公司;二甲基亚砜(DMSO)购自 Amresco公司;蔗糖(sucrose)购自北京鼎国生物科技有限公司;乙酰胺(acetamide)购自上海楷洋生物技术有限公司;注射用青霉素钠(benzylpenicillin sodium for injection)购自哈药集团制药总厂;注射用硫酸链霉素(srteptomycin sulfate for injection)购自大连美罗大药厂;基础液(L-15*液)在湖南农大动物医学院的临床分子医学实验室自行配制(LeibovitzL-15+100 mL/L NBS+100IU/mL青霉素钠+100 IU/mL硫酸链霉素)。

1.1.3 玻璃化冷冻液和解冻液(pH7.2～7.4)

玻璃化冷冻液和解冻液按下列配方配制,pH为7.2～7.4。

预平衡液:1 mol/L二甲基亚砜+L-15*;平衡液(E1):200 mL/L乙二醇+0.5 mL/L蔗糖+L-15*;冷冻液(E2):400 mL/L乙二醇+0.5 mL/L蔗糖+L-15*解冻液1(E3):0.5 mol/L蔗糖+L-15*;解冻液2(E4):0.25 mol/L蔗糖+L-15*;解冻液3(E5):0.125 mol/L蔗糖+L-15*。

1.2 方法

1.2.1 供体卵巢采集 断颈处死1日龄供体雌鼠,体表用750 mL/L酒精消毒。在洁净工作台中体视显微镜下摘取卵巢,放入装有预平衡液培养皿中,去掉卵巢周围的包膜,显微照相。

1.2.2 卵巢组织的玻璃化冷冻保存 先将没有封口冻存管固定在冷冻套管上,使冻存管中盛有液氮;然后室温下在预平衡液中分离卵巢约5 min,在E1中冰水上(0℃)平衡15 min,在 E2中冰水上(0℃)处理5 min,渗透完成后用自制小吸管吸住卵巢组织,最后将含卵巢组织的小滴直接滴入到准备好的冻存管中,冻存管放置在液氮罐口附近;卵巢全部滴入冻存管后,直接放入液氮罐中储存,冻存管不封口。

1.2.3 卵巢组织的解冻程序 液氮中储存2 d～7 d后取出冷冻存管,置室温中30 s,再放入37℃水浴中解冻30 s,然后将卵巢组织块依次移入E3、E4、E5液中,每次置室温5 min;最后把卵巢组织移入L-15*液中,在室温下分3次漂洗共5 min,置37℃温箱中待用。

1.2.4 肾囊下卵巢移植 受体腹腔注射10 mL/L戊巴比妥钠0.25 mL/只～0.3 mL/只,进行全身麻醉,背部剪毛,用750 mL/L只酒精消毒;沿背中线剪开皮肤,钝性分离皮下组织,在腹壁剪一小口,稍挤压腹部,暴露肾脏;用锐利眼科镊在肾囊上撕开一个小口,插入自制玻璃探针分离肾囊膜与肾组织;用自制小吸管吸住卵巢送入肾囊下,左肾移植卵巢2个;在肾脏表面滴加青、链霉素液,还纳肾脏,缝合切口。操作在洁净工作台中体视显微镜下进行,所用手术器械和玻璃用品等采用干热消毒。

对手术后小鼠进行保温,待其苏醒后放入小鼠饲养笼中进行常规饲养,观察其健康状况。

1.2.5 卵巢移植体回收 卵巢移植当天为0 d,根据试验分组于预定时间断颈处死受体小鼠,取出卵巢移植肾,对移植卵巢(移植体)进行形态学观察记录,在体视显微镜下进行显微照相;移植体连同卵巢移植肾脏放入中性福尔马林中保存固定,用于组织学检查。

计算移植有效率和卵巢回收率。卵巢移植后,在试验期内存活生长,如明显增大、对表面有血管分布并凸出肾脏表面的定为可回收卵巢,有可回收卵巢的受体为有效受体。

移植有效率(%)=(有效受体/移植受体数)×100%

卵巢回收率(%)=(可回收卵巢/移植卵巢数)×100%

1.2.6 组织学检查 组织切片的制作参照闫国和等[1]的方法,对经100 mL/L中性福尔马林液固定好的组织样品进行修整,使之符合石蜡组织切片要求。然后进行脱水、透明、浸蜡和石蜡包埋;进行连续切片,分段取样铺片,切片厚度为 5 μ m,对铺好的玻片放入烘箱,58℃过夜烤片;进行HE(haematoxylin–eosin)染色:对烤好的切片进行脱蜡、脱二甲苯、苏木素染色、盐酸酒精分化、兰化、伊红复染和封片,42℃烘片12 h,用组织切片盒保存备用。

2 结果

2.1 形态学观察

从新生1日龄小鼠中取出卵巢,采用微滴法玻璃化冻存方法处理卵巢,卵巢复苏后移植到雄性昆明系雄性小鼠受体肾囊下,本试验共有雄性受体鼠19只,每侧肾囊移植2枚卵巢,总共移植卵巢38枚。饲喂28 d后有效回收移植卵巢的受体鼠为17只,回收卵巢数30枚,受体总有效率为89.4%;有效回收移植卵巢30个,卵巢总回收率为78.9%。移植卵巢大部分能够存活、生长增大。

解冻后1日龄小鼠卵巢(图1A)移入肾囊后外观呈灰白色小点,无凸出感(图1C);移植后28 d的卵巢移植体明显增大,呈圆形或肾形凸起,乳白色(图1D、E),表面可见有网状血管分布(图1E);部分卵巢移植体上可观察到暗红色斑点,似红体或出血卵泡(hemorrhagic follicle)(图1F)。

图1 移植卵巢形态学观察Fig.1 Observation on morphology of ovaries g rafted

2.2 移植卵巢生长发育的比较

1日龄小鼠卵巢平均直径为 501.2 μ m±39.7 μ m,移植后28 d回收的卵巢显著生长增大,平均直径与1日龄卵巢相比显著增加(表1)。

2.3 移植卵巢卵泡生长发育

1日龄小鼠卵巢切片中未观察到卵泡,大核细胞为卵原细胞(oogonium)(图2A),尚未组装形成原始卵泡(primordial follicle);经过冷冻保存程序后小鼠卵巢切片并没有明显的变化(图2B)。

表1 冷冻保护剂处理及移植期移植卵巢大小的比较Table 1 Ovaries treated by cryoprotectant and the size of ovarian grafts in different time

图2 睾丸在位受体组卵巢卵泡发育的比较Fig.2 Development of follicle in ovaries from intact male recipients

3 讨论

卵巢组织的冷冻保存与移植被认为是实现雌性动物生殖资源保存和有效利用的一种有效途径。近10年来卵巢冷冻移植研究已取得重要进展,人们相继利用新鲜卵巢移植和冷冻卵巢移植获得的卵母细胞经体外受精和胚胎移植技术获得新生仔鼠[3]、小猴[4],并于2004年出生了首例冷冻胎儿卵巢移植健康女婴[5-6]。这些研究结果不仅表明新鲜或冷冻的卵巢移植后仍有可能保持卵巢卵泡及卵母细胞的正常发育潜能,而且也为实现雌性动物生殖资源保存提供了新方法。目前卵巢组织的冷冻保存主要采用程序化冷冻的方法,但对卵巢快速冷冻方法研究较少。覃波霖等[7]采用程序化冷冻方法对1日龄小鼠卵巢进行了冷冻保存并移植到雌性受体小鼠,结果显示每侧肾囊移植2枚卵巢的受体鼠的卵巢回收率可达到45.0%。本研究利用玻璃化冷冻保存原理,采用直接投入液氮方法,对经EG低温冷冻保护剂处理的1日龄小鼠卵巢进行快速冷冻,解冻后移入雄性受体鼠的卵巢移植体能够继续生长并完成原始卵泡的形成和各级卵泡的发育,卵巢冷冻移植后28 d的受体有效率达89.3%,移植后28 d的卵巢回收率为78.9%。这说明快速的玻璃化冷冻方法也能够有效的保存卵巢的组织活性,达到与程序化冷冻方法相似的保存效果,具有长期保存雌性动物生殖资源的应用价值。

本研究中采用的冷冻方法都获得了良好的效果,可能是由于改进了以下几个方面:①为降低损伤程度,一个可行的方法是将卵巢组织依次放入浓度逐渐升高的玻璃化冷冻保护液中,同时将平衡的时间逐渐缩短[3,8]。②分离卵巢在室温下于1 mol/L DMSO中进行(大约5 min～10 min),再放置放入冷冻保护剂中,通过这个步骤能使DMSO渗透到卵巢组织中,从而降低EG的毒性。③所用的冷冻程序都在0℃的环境下进行的,除了1 mol/L DMSO预处理卵巢组织及复温冻存的卵巢组织是在室温温度条件下进行的,冷冻保护剂在低温条件下处理卵巢组织是一个关键步骤,氧气需求的减少会使卵巢组织的损伤减低到最少而且减少冷冻保护剂对卵巢组织的毒性。④在复温时冻存卵巢组织可能会受到脱玻化作用的损伤,为了避免这个反应,一般选择小的卵巢或将需要冻存的卵巢切成小的块状组织。本试验就是用1日龄的小鼠卵巢来避免这个反应。EG微滴法玻璃化冷冻保存对卵巢的保护效果最好。冻存管预先放置在液氮罐中里面使得里面装满液氮,渗透完成后用自制小吸管吸住卵巢组织,将含组织小滴直接滴入到准备好的冻存管中,冻存管放置在液氮罐口附近,直接放入液氮罐中储存,冻存管不封口。由于EG的细胞毒性较小,渗透速度快,通过直接与液氮接触,使液体通过极快的降温速度而使细胞内外均形成玻璃化的过程,跳过冰晶期或最大限度地减少细胞内冰晶的形成,因此降低对细胞的损伤。

试验结果显示,保护剂需要相应的冷冻保存方法才能更有效地避免冰晶的形成,保证冷冻卵巢复温后的生长发育活性。

在卵巢异位移植中,移植体存活的主要障碍是血管未能再生,导致移植组织坏死[9]。移植体血液供应的重新建立受移植组织大小、移植部位和血管生长因子等因素的影响。啮齿类动物的卵巢小,移植后24 h～48 h内即可发生血管再生,因此,卵巢移植部位应选择血供丰富的部位,如肾被膜下[10-11]、卵巢所在部位腹膜下[12]和皮下[13-14]等,本研究在移植体的外观形态和组织学观察发现,存活的移植体表面和内部有较多的新生血管,与正常卵巢相比,血管密度明显增加,管径增大。袁安文等[15-17]报道新生鼠卵巢异性受体移植的回收率高达92.9%的结果相一致,说明1日龄小鼠卵巢体积小(平均直径为501.2 μ m ±39.7 μ m),移入供血丰富的肾脏后可以获得高的卵巢存活率。尽管卵巢组织在冷冻和解冻过程中可能受到一定程度的损伤,但本试验中微滴冷冻组的卵巢移植存活率仍保持较高的水平(卵巢回收率为78.9%),与覃波霖等[7]报道1日龄小鼠冷冻卵巢移入雌性受体的存活率(82.5%)类似。这说明在本试验的移植时期内,冷冻卵巢移植后的存活率主要受冷冻损伤的影响,雄性受体具有与雌性受体相似的移植效果。然而,在成年小鼠冷冻卵巢肾囊下自体与异体移植研究中发现,异体移植组的存活卵巢少于自体移植组,并认为可能与异体移植后的免疫排斥有关[18]。但是在本试验的卵巢异性移植中,卵巢移植体与肾脏交界处没有观察到排斥反应的炎性外观变化与组织学变化,卵巢移植体容易从肾脏中剥离。同样,袁安文等[15-17]也观察到与此相一致的结果。这可能与1日龄小鼠卵巢具有较低的免疫原性或肾囊下被认为是一免疫缺损区[19]等有关,或者免疫排斥反应的发生需要一个更长的时期。

[1]刘健鹏,王爱物,曹 婧,等.昆明小鼠卵母细胞体外成熟培养条件优化[J].动物医学进展,2008,29(9):58-61.

[2]闫国和,古德全,林 远,等.制作鼠组织优质石蜡切片方法的探讨[J].第三军医大学学报,2002,24(7):875.

[3]Migishima F,Suzuki-Migishima R,Song S Y,et al.Successful cryopreservation of mouse ovaries by vitrification[J].Biol Reprod,2003,68(3):881-887.

[4]Lee D M,Yeoman R R,Battaglia D E,et al.Live birth after ovarian tissue transplant[J].Nature,2004,428(6979):137-138.

[5]Donnez J,Dolmans M M,Demy lle D,et al.Live birth after o rthotopic transplantation of cryopreserved ovarian tissue[J].Lancet,2004,364(9443):1405-1410.

[6]Kim S S,Hwang I T,Lee H C.Heterotopic autotransplantation of cryobanked human ovarian tissue as a strategy to restore ovarian function[J].Fertil Steril,2004,82(4):930-932.

[7]覃波霖,陈学进,施振旦,等.小鼠卵巢冷冻移植后卵泡发育和卵母细胞成熟的研究[J].生理学报,2006,58(1):41-46.

[8]Shi W Q,Zhu S E,Zhang D,et al.Improved development by Taxol pretreatment after vitrification ofin vitromatured porcine oocy tes[J].Reproduction,2006,131(4):795-804.

[9]Nisolle M,Casanas-Roux F,Qu J,et al.Histologic and ultrastructural evaluation of fresh and frozen-thawed human ovarian x enografts in nude mice[J].Fertil Steril,2000,74(1):122-129.

[10]Aubard Y.Ovarian tissue xenografting[J].Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol,2003,108(1):14-18.

[11]Hernandez-Fonseca H,Bosch P,Sirisathien S,et al.Effect of site of transplantation on follicular development of human ovarian tissue transplanted into intact or castrated immunodeficient mice[J].Fertil Steril,2004,81(Suppl 1):888-892.

[12]Tryde Schmidt K L,Yding Andersen C,Starup J,et al.Orthotopic autotransplantation of cry opreserved ovarian tissue to a woman cured of cancer-follicular growth,steroid production and oocyte retrieval[J].Reprod Biomed Online,2004,8(4):448-453.

[13]Oktay K,Buy uk E,Rosenwaks Z,et al.A technique for transplantation of ovarian cortical strips to the forearm[J].Fertil Steril,2003,80(1):193-198.

[14]Oktay K,Buyuk E,Veeck L,et al.Embryo development after heterotopic transplantation of cry opreserved ovarian tissue[J].Lancet,2004,363(9412):837-840.

[15]袁安文,王乃东,周卫国,等.移植时间对小鼠卵巢卵母细胞在雄性体内生长发育的影响[J].湖南农业大学学报,2008,34(1):56-60.

[16]袁安文,彭南妮,王乃东,等.新生小鼠卵巢移植雄鼠肾囊下卵泡的生长发育[J].动物学报,2008,54(2):265-270.

[17]袁安文.小鼠异性移植卵巢卵泡与卵母细胞发育研究[D].湖南长沙:湖南农业大学,2007.

[18]王燕蓉,庞 龙,沈新生.不同浓度保护剂对超述冻存小鼠卵巢组织效果观察[J].生殖与避孕,2005,25(1):8-13.

[19]汪 萍,王燕蓉,沈新生,等.成年大鼠卵巢异体异位移植的实验研究[J].宁夏医学院学报,2004,26(1):6-8.

Study on Allograft and Vitrification of Newborn ouse Ovarian Tissue in Male Recipient Mice

LIAO Hai-yan1,ZHOU Wei-guo2,WANG Fang-jian3

(1.Hunan First Normal College,Changsha,Hunan,410205,China;
2.Animal Epidemic Prevention Supervision Station,Yongzhou,Hunan,425006,China)

The cryopreservation and transplantation of ovarian tissue is considered as one of new technique to build mammal ovum library in the future.To explore methods of vitrification of ovarian tissue and the ideal cryopretectants and build the cryopreservation and transplantation technology of livestock ovary tissue,the vitrified ovarian tissue of newborn mice was allografted underneath the kidney capsule of male recipients in the experiment.1-day-old mouse ovarian tissue were theated by the cryovial method vitrification method.The thawing ovarian tissue was grafted in the kidney capsule of male mouse recepients,19 male recipients used and 38 ovaries form1-day-old mice grafted,with 2 ovaries in each capsule.Oarian grafts were recovered 28 days after transplantation.the grafts were successfully recovered form 17 of the male recipients and the recovery rate was 89.4%in total;the 30 ovaries were successfully recovered form 17 of the male recipients and the recovery rate was 78.9%in total.T he above results demonstrated that the primordial folficles in newborn mouse ovaries were capable of sustaining freezing and thawing,and reinitiating development following xenograft into kidney capsule in adult recipient female mice.

mice;vitrification;ovary transplantation

S853.52

A

1007-5038(2010)09-0071-05

2010-03-03

湖南省大学生研究性学习和创新性实验计划项目(湘教通[2009]320)

廖海艳(1974-),女,湖南邵阳人,讲师,硕士,主要从事基础生命科学研究。