Pm0217F紫外诱变株间生物学特性差异研究*

田雪莲， 陆伟东， 丁 伟**， 卯 霞， 田雪珊， 张 军

（曲靖师范学院云贵高原生物多样性研究所，云南 曲靖 655011；2.曲靖市疾控中心，云南 曲靖 655000）

蛹虫草Cordyceps militaris(Fr.)Link，又名北冬虫夏草，为子囊菌亚门 （Ascomycotina）、球壳菌目 （Sphaeriales）、 麦角菌科 （Clavicipitaceae）、 虫草属 （Cordyceps）真菌[1]，是虫草属的模式种，是蛹草拟青霉（Peacilomyces militaris）的有性型[2]。野生蛹虫草分布于我国东北、华北、西南地区的10多个省 （市）、自治区。与冬虫夏草相比，二者无根本性质差异，均含有虫草素、虫草酸、虫草多糖、SOD、粗脂肪、粗蛋白、氨基酸、无机元素等且含量都很丰富，而且有些成分高于冬虫夏草[3]，是冬虫夏草的最佳替代品。通过对1株转管17次，且出现野生性状退化的菌株Pm0217F进行紫外诱变，比较不同诱变菌株之间的生物学特性，以期为生产中改良菌株和菌株筛选提供一定的理论依据。

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌种

Pm0217F菌株是Pm02菌株的第17代传代菌株。该菌株已出现明显的菌种退化现象。菌株培养14 d菌落白色，背面出现暗紫色。人工代料培育不形成子实体原基，在培养基表面形成1层菌膜。

1.1.2 设备

ZHWY-2102恒温振荡器，上海博讯实业有限公司医疗设备厂；LRH-150-G光照培养箱，广东省医疗器械厂；紫外可见分光光度仪，安捷伦科技6010；恒温水浴锅，江苏金坛中大仪器厂；电热恒温干燥箱，成都天宇实验设备责任有限公司；不锈钢压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的制备

沙氏液体摇瓶培养基：葡萄糖2%、麦芽糖0.5%、酵母浸膏0.5%、蛋白胨1%，pH自然；沙氏琼脂斜面、平板培养基：同前，加琼脂2%。

1.2.2 蛹虫草菌株的紫外线诱变

分别取1 mL菌悬液置于9 cm倒好培养基的培养皿中，用涂布法涂匀。然后将其放在功率为30 W的紫外灯下，垂直距离40 cm处进行诱变，诱变时间梯度为0 s、30 s、60 s、90 s、120 s。诱变结束后将各培养皿倒置于26℃培养箱里避光培养7 d，并进行纯培养，获得诱变菌株。诱变菌株编号分别为A、B、C、D、E。

1.2.3 诱变后各菌株的菌落特征及生长速率变化

将上述经过紫外诱变后的菌种用点接法接种到平面培养基上，每菌株做3个平行，从第48小时起，每隔48 h测量1次菌落的直径，并根据记录的数据绘制出对应的生长曲线。并于第14天进行菌落形态观察、描述和记录。

1.2.4 扦片培养显微观察

将扦片培养了7 d的各菌株用乳酸石碳酸棉蓝染色剂染色后观察，分别随机的选取10个视野进行观察，统计诱变后各菌株大孢子千分率、分生孢子不同聚集类型的比例。

1.2.5 蛹虫草诱变后的虫草菌素含量的测定

将上述各紫外线诱变株分别接种到液体培养基中，接种量1 mL，发酵液为 80 mL·瓶－1，每菌株3个平行，于26℃条件下摇瓶培养7 d。将发酵液和菌丝体一起转置离心管中，2 500 r·min－1离心10 min，进行菌液分离，去其上清液，用双蒸水冲洗菌丝，再离心，如此重复3次，得到基本无培养基的菌丝体，将其置于鼓风干燥箱中，55℃烘至恒重，研磨，过60目筛，得菌丝粉。

精密称取上述各待测样品粉末0.5 g置于试管中，加入20%乙醇3 mL，水浴30 min，定容，稀释，过滤，得待测样品液，用紫外分光光度计进行检测。

1.2.6 虫草菌素紫外分光光度测定标准曲线的建立

根据虫草菌素的最大吸收波长为259 nm，在此波长下，绘制虫草菌素含量标准曲线，数据见表1。

表1 虫草菌素标准曲线数据

将表1数据即虫草菌素标准曲线经Excel软件分析，相关系数r=0.9998，其回归方程如下：

式中：C为虫草菌素对照品浓度 （μg·mL－1）；A为259 nm下吸光度。

方程表明， 虫草菌素在 5 μg·mL－1～30 μg·mL－1范围内，与吸光度有良好的线性关系。

2 结果与分析

2.1 各诱变株的菌落特征差异

A：菌落扁平，边缘整齐，白色，菌丝不发达；B：菌落扁平，边缘较整齐，白色，菌丝较发达；C：菌落扁平，边缘整齐，略显淡黄色，菌丝发达；D：菌落中部略隆起，边缘较整齐，白色，菌丝不发达；E：菌落扁平，边缘较整齐，白色，菌丝不发达。

与该菌株的低代传代菌株相比，诱变后的菌株只有C菌株出现了淡黄色，与低代菌株相似。

2.2 诱变后各菌株的生长速率变化分析

紫外线照射后避光培养的菌落生长状况见表2。

表2 紫外线照射后避光培养的菌落生长状况

通过回归方程可得各诱变菌株的生长速率，从表2可以看出各诱变株在相同条件下培养14 d后，其长出的菌落直径有差异，通过无重复双因素方差分析可得：F时间＝181.8517＞Fα＝2.508189， 拒绝原假设 H0， 说明生长时间对菌株的生长有显著影响； F株间＝25.04269＞Fα＝2.7763， 拒绝原假设H0，说明不同菌株间的生长速率有显著差异。

2.3 扦片培养显微观察诱变后各菌株的孢子数量、类型及比例分析

显微观察中发现蛹草拟青霉的分生孢子单孢，透明，光滑。从形状上看有两大类，一类是近球形，直径约为1.5 μm～2.0 μm 的小孢子； 另一类是孢子链顶部的分生孢子， 呈柱状或长椭圆形， 大小约为 （0.8～1.2）μm × （3～7）μm。分生孢子常呈迭瓦状排列或聚集成疏松的孢子头。

2.3.1 各诱变株间大分生孢子大千分率比较

通过扦片观察计数，可得10个视野下大小孢子数量，见表3。大孢子数量较少，可通过统计大孢子的千分率来进行分析，见图2。

图2 大孢子千分率

表3 10个视野下大小孢子数量

从图2可以看出，不同诱变菌株间大孢子的千分率不同，其中诱变时间为60 s的C菌株，其大孢子千分率最大，且大孢子千分率随紫外线照射时间的延长呈现出先升高后降低的趋势。

2.3.2 各诱变株间分生孢子聚集类型比较

不同诱变株间头状聚集及叠瓦状聚集方式的统计结果见表 4。

表4 不同诱变株间头状聚集及叠瓦状聚集方式的统计

从表4可以看出，随着诱变时间的增加，孢子头状聚集方式的比例先呈下降趋势后呈上升趋势。当诱变时间为60 s时孢子头状聚集方式的比例最低。而孢子叠瓦状聚集方式的比例与孢子头状聚集方式的比例变化正好相反。

2.4 不同紫外线照射时间对Pm0217F菌株虫草菌素含量影响

用紫外分析仪测得各菌株发酵培养菌丝中虫草素百分含量，结果见表5。

表5 各诱变株菌丝中虫草菌素百分含量

从表5可以看出，不同时间梯度的紫外诱变对Pm0217F菌株虫草菌素的产量有较为明显作用，随着诱变时间的增加，虫草菌素呈上升趋势，当诱变时间为60 s时虫草菌素百分含量达到最大值。之后，随着诱变时间的增加，诱变株的虫草菌素含量又呈下降趋势。

3 结论与讨论

从5个诱变株的各生物学指标来看，当诱变时间为60 s时，其培养性状、生长速率、次生代谢产物虫草素产量都较其它诱变株好，因此可初步确定最佳诱变时间为60 s。另外，综合以上实验结果可以初步确定，大孢子比例增加，同时孢子叠瓦状聚集方式比例也增加时，诱变菌株的虫草菌素百分含量也相应增加，且在培养性状上与低代菌株较相似。因此可考虑在选育菌种过程中选择大孢子比例高，且拟青霉型产孢结构比例大的菌株，可简化菌株筛选程序。

[1]魏景超.真菌鉴定手册[M].上海：上海科学技术出版社，1979.

[2]梁宗琦.中国真菌志－第32卷虫草属[M].北京：科学出版社，2007.

[3]李楠，宋健国，刘金云，等.蛹虫草与冬虫夏草化学成分比较[J].吉林农业大学学报， 1995， 17(增刊)： 80－83.