药用真菌桑黄的系统发育分析*

王 丹，邹 莉，杨民宝，伊洪伟，罗 丽，王 义

（东北林业大学林学院，黑龙江 哈尔滨 150040）

“桑黄”是担子菌中针层孔菌属 （Phellinus Quel.）一类具有重要药用价值的大型真菌，近几年来成为传统中药研究和开发的热点，但由于这类真菌在药用功效上确实相同或相似，因此在学术和市场交流中出现了多种同种异名、同名异种的混乱 “桑黄”物种[1]。

通过对东亚地区 “桑黄”物种[2]进行了诠释，在传统的形态分类的基础上，试图通过ITS序列分析，对中国的鲍氏针层孔菌 （桑黄）（Phellinus baumii）过去定名为裂蹄针层孔菌 （P.linteus）与朝鲜桑黄 （Phellinus linteus）、韩国桑黄 （Phellinus linteus）进行同源性比对，确定其亲缘关系，证明是否是同一物种鲍氏针层孔菌 （桑黄）（P.baumii），为其分类鉴定提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

菌株朝鲜桑黄 （Phellinus linteus）、韩国桑黄 (Phellinus linteus)、中国桑黄 (Phellinus baumii)、中国桑黄火木针层孔菌 （Phellinus igniarius）、斜生褐孔菌 (Phaeoponus obliquus)由东北林业大学潘学仁教授提供，文中分别以sh1、sh2、sh3、sh4、sh5表示，其中朝鲜桑黄和韩国桑黄其产地和形态特征是不同的。

DNA提取和检测：用接种钩刮取培养基表面适量菌丝，置于研钵中用液氮冷却，迅速研磨成细粉，将其放入1.5 mL离心管中，加入少量的 PVP、500 μL预热的 2%CTAB提取缓冲液及20 μL β－疏基乙醇，轻轻混匀，置65℃水浴锅中温浴30 min，其间不时轻轻摇动离心管，使材料充分混匀。取出放至室温，加入500 μL氯仿:异戊醇（体积比 24∶1）， 缓慢颠倒混匀， 12 000 r·min－1离心 10 min。将上清液转入另一离心管中，弃下层。重复抽提2次，直至中间层透明。吸取上清液放入1.5 mL离心管中，加入3 mol·L－1NaAc，混匀后，加入2/3体积的异丙醇，室温沉淀1 h以上，12 000 r·min－1离心10 min，弃上清。加入1 mL预冷的70%乙醇洗涤1次，再加入1 mL预冷的无水乙醇洗涤，以除去DNA表面附着的盐或试剂小分子物质。室温干燥后，加入30 μL的无菌去离子水溶解DNA，放于－20℃冰箱中保存备用。

1.2 引物序列

ITS1：5’－TCCGTAGGTGAACCTGCGG －3’； ITS4： 5’－TCCTCCGCTTATTGATATGC－3’，引物由上海生工生物公司合成。

1.3 PCR扩增反应体系

制备 25 μL 反应体系， 其中 ddH2O 18.375 μL、 模板DNA 1 μL、 10×buffer （Mg2+）2.5 μL、 浓度为 10 μmol·L－1正 反 向 引 物 （ITS1 和 ITS4）各 0.5 μL、 dNTP 2 μL、TaqDNA 聚合酶 0.125 μL。

1.4 PCR反应程序

94℃预变性 5 min， 95℃变性 30 s， 58℃退火 45 s，72℃延伸2 min，30个循环，72℃延伸7 min，4℃保存。

1.5 PCR产物的检测

取5 μL PCR产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.6 PCR产物的测序

PCR扩增产物，委托上海生工生物公司测序后，将测序的ITS序列在NCBI Genbank进行BLAST，对获得的同源序列进行序列分析。利用BioEdit的Sequence工具下的Nucleotide Compisition分析各菌株ITS序列的长度及核苷酸G+C含量，采用MEGA3.1系统发育分析软件中的UPGMA法和Clustal X1.83构建系统进化树。

图1 PCR产物电泳效果图

供试菌株ITS分布情况见表1，G+C的含量比较见表2，同源性比较见表3。

表1 供试菌株ITS分布长度的比较

表2 供试菌株ITS的G+C含量分布情况

表3 供试菌株ITS同源性比较

2 结果与分析

2.1 rDNA ITS序列的扩增、测序

扩增结果见图1。

从图1可看出，引物ITS1和ITS4能成功扩增出5个菌株的ITS区段，经测序5个菌株的ITS序列片段长度分别为704 bp、669 bp、681 bp、588 bp、738 bp，所得序列结果经碱基比对和分析后提交NCBI中的Genbank数据库，并获得Genbank中的登录号，分别为FJ190410、FJ190411、 FJ190412、 FJ190413、 FJ190414。

2.2 供试菌株亲缘关系分析

从表2可以看出，5个供试菌株中其中sh1、sh2、sh3之间的5.8S rDNA的G+C具有100%的同源性，说明其保守性和亲缘关系均相当强。从以上数据可以看出，作为对照的针孔菌属 （Phaeoponus）的sh5明显和针层孔菌属（Phellinus）的sh1、sh2、sh3亲缘关系较远，这说明桑黄菌株亲缘关系的鉴定可以采用ITS序列分析的方法，sh1、sh2和sh3是同一物种，sh4和sh5是另外2个不同的物种。

2.3 系统发育分析

根据美国生物中心 （NCBI）网站提供的真菌ITS1和ITS2的相关序列来确定供试菌株的亲缘关系，经BLAST比对，下载了与供试菌株同源性较高的ITS序列，通过Clustal X软件对其进行比对，并用分子进化遗传分析软件（Clustal X1.83，Mega 3.1）构建分子系统树，如图2所示。

图2 5个菌株的UPGMA系统发育树

从系统发育图中可以看出，与sh1、sh2、sh3亲缘关系较近的是基因库中提供的Phellinus linteus、Phellinus baumii、 Inonotus linteus， 而sh4与Phellinus laevigatus较近、sh5与Inonotus obliquus较近。经BLAST比对，基因库中与sh1同源性高于90%以上的DNA序列有61个菌株，其中Phellinus linteus 25个，Phellinus baumii 15个；与sh2同源性高于90%以上的有73个，其中Phellinus linteus 27个，Phellinus baumii 23个；与sh3同源性高于90%以上的有54个，其中Phellinus linteus 23个，Phellinus baumii 17个；而与sh4同源性高于90%以上的菌株大多数为Phellinus laevigatus；与sh5同源性高于90%以上的菌株大多数为Inonotus obliquus。

从上述分析可看出，sh1、sh2、sh3是同一物种，名称混乱的 “桑黄”，而sh4和sh5分别是火木针层孔菌和斜生褐孔菌。

亲缘关系较近的sh1、sh2、sh3的ITS序列与基因库中提供的Phellinus linteus、Phellinus baumii都有较高的同源性，在这些菌株中，Phellinus linteus占多数。从数据显示中可以认为sh1、sh2、sh3与Phellinus linteus的亲缘关系较近，因此sh1、sh2、sh3的拉丁学名应为Phellinus linteus。但是对于这些Phellinus linteus的ITS序列，都是由韩国和中国学者提供，并没有发现有中美洲和南美洲学者提供的，戴玉成等从形态学角度研究确定Phellinus linteus的自然分布仅在中美洲和南美洲，而中国、韩国、印度、俄罗斯以及日本等国家并没有自然分布，这些国家学者所描述的菌物 “Phellinus linteus”，其正确的物种名称应为Phellinus baumii[3,4]。所以基因库中由韩国和中国学者提供的与供试菌株同源性较高的的Phellinus linteus，其真正拉丁学名应为Phellinus baumii，也就是与供试菌株sh1、sh2、sh3同源性较高、亲缘关系较近的菌株应为Phellinus baumii。经上述分子生物学分析，笔者支持戴玉成的观点，中国、朝鲜、韩国交流的 “桑黄”的物种为鲍氏针层孔菌（P.baumii Pilat），而桑黄、桑耳、针裂蹄、裂蹄针层孔菌均为鲍氏针层孔菌的异名[5]。

3 结果与讨论

对于分类混乱的、学名不定的菌株，经BLAST分析比较时，不能只看基因库中显示的菌株名称来确定其亲缘关系，因为，基因库中学者提供的菌株学名有些是在分类比较混乱的时候提供的，这个时候提供的并不一定是其真正的学名，例如笔者在提供 “桑黄”菌株时，并不确定其真正学名为Phellinus linteus，只是目前大多数学者认为的，所以在提交时就以Phellinus linteus提交，结果在基因库中最后显示的为Phellinus linteus。

从本试验结果来看，由于ITS片断较小和短，因此对于菌株之间的区分有一定的局限性，但对一些大的区段如18S rDNA效果会更好。笔者建议，结合形态特征对中国的 “桑黄”与中美洲和南美洲的Phellinus linteus ITS序列进行比较分析，进一步确定其真正的亲缘关系。遗憾的是，笔者没有在基因库中发现与 “桑黄”菌株相似度较高的由中美洲和南美洲学者提供的Phellinus linteus的ITS序列，且没有收集到中美洲和南美洲的Phellinus linteus作为对照菌株。

[1]曾念开，王秋颖，苏明声.桑黄基原物种的探讨[J].中国食用菌，2008， 27(2)： 56-59.

[2]潘学仁，邹莉.东亚地区 “桑黄”物种问题探讨[J].中国食用菌，2008， 27(1)： 63-64.

[3]张小青，戴玉成.中国真菌志第二十九卷锈革孔菌科[J].北京：科学出版社，2005.

[4]Dai YC,Xu MQ.Studies on the medicinal polypore,Phellinus baumii,and itskin,P.linteus[J].Mycotaxon,1998,67(1):191-200.

[5]戴玉成.药用担子菌-鲍氏层孔菌 （桑黄）的新认识[J].中草药，2003， 34(1)： 94-95.