浸润性乳腺癌中hRad17和MCM7的表达及临床病理意义

田秀春,范钦和,顾学文,王翠梅

(1.江苏省苏北人民医院病理科,江苏扬州,225001;2.南京医科大学第一附属医院病理科,江苏南京,210029)

hRad17基因是1988年[1]发现的一种细胞周期检测点基因,近年来越来越多的研究表明,hRad17基因在肿瘤发生、发展中起到重要作用。MCM7蛋白是真核细胞DNA复制所必需的分子。本研究通过免疫组织化学方法检测hRad17和MCM蛋白在乳腺癌组织及良性病变中表达情况,并结合各项临床病理资料,旨在进一步探讨hRad17和MCM7蛋白在乳腺癌中的表达意义及相互关系。

1 材料与方法

1.1 材料

收集江苏省苏北人民医院 2003年1月～2004年8月浸润性乳腺癌标本90例及20例良性病变标本20例。手术标本经10%中性福尔马林固定,取材后常规包埋切片,连续 4 μ m 厚切片。浸润性乳腺癌按照世界卫生组织WHO乳腺癌分类分级标准[2]进行病理学分类分级:90例中,浸润性导管癌70例,浸润性小叶癌10例,髓样癌5例,其他5例。组织学分级:Ⅰ级15例,Ⅱ级46例,Ⅲ级29例。患者年龄35～81岁,平均51岁。所有患者术前均未接受内分泌治疗或化疗。

1.2 试剂

hRad17购自Santa Cruz公司,MCM7购自Neo Marker公司。

1.3 免疫组化染色

采用免疫组化S-P法,切片经脱蜡、梯度乙醇脱水后到蒸馏水,然后经枸橼酸液高温高压抗原修复,用10%H2O2封闭内源性过氧化物酶10 min,PBS液冲洗3次×2 min,滴加hRad17(原液按 1:75稀释)和 MCM7(原液按 1:200稀释)过夜,PBS液冲洗3次×2 min,20%蛋清液封闭内源性生物素30min,PBS液冲洗3次×2 min,滴加二抗,孵育30 min,PBS液冲洗3次×2 min,用DAB显色。以PBS代替一抗作为阴性对照。

1.4 结果判断

hRad17、MCM7标记均以细胞核出现黄色或棕黄色颗粒为阳性细胞。癌细胞无着色或阳性肿瘤细胞数<10%为(-);阳性肿瘤细胞数10%～30%为(+);阳性肿瘤细胞数 30%～70%为( );阳性肿瘤细胞数>70%为( )。

2 结 果

乳腺良、恶性病变中hRad17和MCM7蛋白的表达见表1。

表1 hRad17和MCM7各组中的表达

在90例浸润性乳腺癌组织中,hRad17的阳性表达率为62.2%,MCM 7的阳性表达率为84.4%,2种蛋白表达呈正相关,见表2。

表2 90例润性乳腺癌中 hRad17和MC M7的表达

hRad17和MCM7在Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级浸润性乳腺癌中阳性表达率分别为6.7%、30.0%、25.6%和 12.2%、41.1%、31.1%,在伴有淋巴结转移的乳腺癌中阳性表达率分别为36.7%和45.6%,无淋巴结转移的乳腺癌中阳性表达率为25.6%和38.7%。hRad17和MCM7的表达与乳腺癌病理学分级及淋巴结转移亦呈正相关,见表3、4。

表3 hRad17和MCM7在各级浸润性乳腺癌中的表达

表4 hRad17和MCM7表达与浸润性乳腺癌淋巴结转移的关系

3 讨 论

肿瘤是一类多步骤发生的、多基因突变所致的细胞克隆性、进化性疾病,也是一种细胞周期性疾病。细胞周期不同时相间存在着类似“关卡”式的关键调控点(即检测点),以保证各个细胞周期事件的启动、完成等忠实地按序进行。细胞周期检测点对维护真核生物向下一代传送遗传信息的高保真来说是必需的。

hRad17基因是Parker等[1]于 1988年发现克隆并命名。其位于5号染色体短臂[3],为粟酒酵母rad17和酿酒醇母rad24的同源基因,是一个重要的细胞周期检测点基因。其编码的检测点蛋白hRad17蛋白是具有670个氨基酸的碱性亲水蛋白[1]。hRad17主要参与细胞的G2/M 期阻滞,防止损伤的DNA传到子代细胞。hRad17蛋白结合在染色质上,在发生DNA损伤后,感知DNA的损伤,通过类似RFC/PCNA样作用动员PCNA样rad9-rad1-hus1检测点蛋白复合体(即9-1-1检测点复合体)结合到染色质上,从而激活蛋白激酶AT R/ATM,使下游检测点蛋白及hRad17蛋白发生磷酸化,这一过程为DNA损伤介导的细胞周期G2期捕获,从而有利于损伤的DNA修复[4-5]。

微小染色体维持蛋白(MCM)是20世纪80年代Bik-Kwoon Tye在突变的酵母中发现,然后通过分子和生物学实验方法分离提取出来的。它由至少6个亚单位组成,包括MCM2、MCM3、MCM4/Cdc21、MCM5/Cdc46、 MCM6/Miss5、MCM7/Cdc47,存在于所有真核细胞中。

MCM7为DNA复制许可复合体MCM的关键成员,在控制DNA复制的起始过程中起关键作用[6]。在M 晚期到G1早期,当MCM7和其它分子结合到复制起始点处,才能够启动DNA聚合酶复制DNA过程的开始。S期MCM复合体离开复制起始点,保证DNA复制在一个细胞周期中只有1次。MCM还是DNA复制与延长时的螺旋酶,在复制点及复制延长阶段解开DNA双螺旋结构,为DNA复制提供单链模板[7]。

本实验 MCM7在浸润性乳腺癌中的表达(84.4%)明显高于良性乳腺病变组(30.0%),有显著差异(P<0.01)。MCM7蛋白的高表达不仅使细胞进入增殖周期,促进细胞增殖活性,而且使异常物质在细胞内堆积,引起染色体畸变,导致肿瘤的发生[8]。

本实验hRad17在浸润性乳腺癌中的表达(62.2%)明显高于良性乳腺病变组(10.0%),有显著差异(P<0.01)。其在乳腺癌中过度表达的原因及后果还不确定。

可能是 hRad17的 Ser635和 Ser645位点被ATR/ATM磷酸化后才能发挥检测点功能。DNA损伤时,野生型hRad17过表达细胞出现G2/M 期捕获,而突变型 hRad17(即 Ser635和Ser645位点被丙氨酸替换,不能被磷酸化)检测点通路功能丧失,其过表达不能对DNA损伤作出适当的反应,损伤的DNA既不被检测也不被修复,基因组不稳定性增加,易发生肿瘤。

也可能是肿瘤细胞快速增殖分裂需要高速的DNA复制,而这需要额外的检测活性去捕获,导致hRad17蛋白过度表达。

MCM7是检测肿瘤细胞增殖状态的标志物,可作为反映乳腺癌细胞增殖活性和判断其生物学行为的一个指标。本实验中hRad17与MCM7的表达有相关性(P<0.05),提示hRad17有促进细胞增殖的功能。hRad17还可能通过促进肿瘤细胞增殖活性来对乳腺癌的发生和进展起促进作用。

浸润性乳腺癌的预后与病理学分级、淋巴结转移存在明显的关联。乳腺癌的病理学分级越高或伴淋巴结转移,则患者预后相对越不良。本实验90例乳腺癌组织中hRad17的阳性率62.2%,MCM7的阳性率84.4%,2种蛋白的阳性表达与乳腺癌病理学分级呈相关,有淋巴结转移的癌组织中hRad17和MCM7蛋白的表达强于无淋巴结转移的癌组织,与国内外文献报道相一致[9-10],提示随着hRad17和MCM7蛋白的活性增高,其促进癌组织侵袭和转移的能力也增强。因此hRad17和MCM7蛋白在癌组织中的高表达与病人的不良预后有关。可作为乳腺癌的预后可变量和一个新的治疗靶点。

hRad17基因的高表达提高癌细胞对DNA损伤因素(包括治疗过程中使用的)的耐受性,可考虑采用基因干扰或特异抑制剂阻遏hRad17的表达,从而减少G2/M期阻滞、促进肿瘤细胞凋亡。

而针对复制准许因子MCM功能的抑制以阻断肿瘤细胞的增殖可引起特异的癌细胞灭活作用或许可作为一种新的抗癌靶目标。

综上所述,本研究结果显示,hRad17和MCM7蛋白的表达在浸润性乳腺癌中明显高于良性乳腺病变,同时发现与乳腺癌进展、浸润转移关系密切,并影响其预后,提示hRad17和MCM7蛋白在乳腺癌组织发生、发展、侵袭和转移方面发挥着一定的作用,可作为乳腺癌预后不良的标志,对hRad17和MCM7基因的深入研究有望为乳腺癌的诊断和治疗提供一条有效的途径。

[1]Parker A E,van de Wayer I,Laus M C,et al.Identification of a human homologue of the Schizosaccharomyces pombe rad17+checkpoint gene[J].J Biol Chem,1998,274(34):18340.

[2]Tavassoli F A,Devilee P.WorldHealth Organization classification of tumors.Pathology&genetics of tumors of the breast and female genital organs[M].Lyon:IARC Press,2003:11.

[3]Bluyssen H A,Naus N C,vanos R I,et al.Human and mouse homologs of the Schizosaccharomyces pombe rad17+cell cycle checkpoint control gene[J].Genomics,1999,55(2):219.

[4]Zou L,Liu D,Elledge S J.Replication protein A-mediated recruitment and activation of Rad17 complexes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2003,100(24):13827.

[5]Lindsey-Boltz L A,Bermudez V P,Hurwitz J,et al.Purification and characterization of human DNA damage checkpoint Rad complexes[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(20):11236.

[6]Lei M,Tye B K.Initiating DNA synthesis:from recruiting to activating the MCM complex[J].J Cell Sci,2001,114(8):1447.

[7]Tsao C C,Geisen C,Robert T,et al.Interaction between human MCM7 and Rad17 proteins is required for replication checkpoint signaling[J].European Molecular Biology Organization,2004,23(11):4660.

[8]Ren B,Yu G,T seng G C,et al.MCM7 amplification and overexpression are associated with prostate cancer progression[J].Oncogene,2006,25(10):1090.

[9]Kataoka A,Sadanaga N,Mimori K,et al.Overexpression of Hrad17 in human breast cancer:correlation with lymph node metastasis[J].Clin Cancer Res,2001,7(9):2815.

[10]任占平,石 吉吉,杜 娟,等.乳腺癌组织中HPV16 18E6及MCM7蛋白的达及意义[J].中国肿肿瘤临床,2008,35(6):327.