不同pH值条件下的丝氨酸标准曲线

彭继明，张佑红，徐 鹏，陈 林，马 静，危 威

(武汉工程大学化工与制药学院，绿色化工过程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430074)

0 引 言

丝氨酸是人体中物质代谢、生理活动、抵抗疾病必不可少的物质，在医药、食品、化妆品中有广泛的应用.丝氨酸含量的变化不仅可以为疾病的诊断、治疗效果的观察提供有价值的数据及资料，还是检验食品和化妆品是否合格的重要标准，因此准确测定丝氨酸含量具有极其重要的意义[1-5].测定丝氨酸量的方法有高效液相色谱法[6]，氨基酸自动分析仪法[7-10]，但二者需要较贵重的仪器设备且操作步骤复杂.已有大量的文献报道，用分光光度法测定丝氨酸的含量，准确率极高，与氨基酸自动分析仪检测的含量的误差在2%以内[11].因此，氨基酸与茚三酮反应在临床检验、卫生分析、食品工业和药品检验等方面被广泛采用，在蛋白质合成和结构鉴定中也常用来完成定性和定量测定[12-14].该反应受多种因素的影响，主要有：反应pH值、显色剂含量、反应时间、温度、氨基酸种类等[15-18].关于反应的最佳pH值的报道有很多，但观点并不一致，从pH值4.0～9.0为最佳均有报道[19-20].

在实际应用的反应体系中，基于反应体系的特点，准确测定丝氨酸的含量时，不宜加入过多的酸或碱调节pH值(因为加入酸或碱引起的体积变化，会导致丝氨酸浓度发生较大变化).研究丝氨酸磷脂制备体系中的丝氨酸含量时，体系存在以下几个特点：a.丝氨酸与茚三酮反应，在处于文献报道的缓冲溶液最佳pH值时，磷脂酶D的活性有可能丧失(当pH为4.0～7.0时，磷脂酶D有活性.b.在酸性、碱性和中性环境中，丝氨酸与茚三酮反应的机理不同，生成的有色物质也不相同.c.为了研究酶的动力学，反应在pH值分别为4.5，5.0，5.5，6.0，7.0的缓冲液中进行，缓冲液的pH值难以调至文献报道的丝氨酸与茚三酮反应的pH值.d.实验过程中测定最佳反应时间和酶量时，需连续取样，每次取样量为0.2 mL(取样量较小)，加入酸碱调节pH值至最佳，容易引起较大的误差.为了获得磷脂酶D在丝氨酸磷脂制备体系中的最佳pH值，需要得到丝氨酸在几种不同pH值下的标准曲线.

本实验采用茚三酮显色法，测定了丝氨酸与茚三酮反应的最佳时间和相对用量，并确定丝氨酸在pH值分别为4.5，5.0和6.0时的丝氨酸标准曲线.

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

试剂:卵磷脂(优级纯)，丝氨酸(优级纯), 南京奥多福尼生物科技有限公司生产；磷脂酶D(优级纯)，Streptomyces Sp.Glycerophospholipid specific； 茚三酮 (分析纯)，氯化亚锡 (分析纯), 国药集团化学有限公司生产； 其他试剂均为分析纯试剂仪器：HH-S型恒温水浴锅，上海东玺制冷仪器有限公司生产；Mk3酶标仪， BCD-251FBNW超低温冰箱，上海热电仪器有限公司生产；PB-10pH测定仪，北京赛多利斯仪器有限公司生产；AL204型电子天平，梅特勒—托利多仪器(上海)有限公司生产.

1.2 实验原理

α—氨基酸在弱酸性溶液中与茚三酮共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后茚三酮与反应产物—氨和还原茚三酮发生作用，生成紫色物质，用分光光度法测定反应后溶液的吸光度值，绘制丝氨酸浓度与吸光度值对应的标准曲线.

1.3 试验步骤

1.3.1 溶液的制备a.0.02 mol/L丝氨酸标准溶液的配制：准确称取0.105 1 g L—丝氨酸(质量分数不低于99%)溶解定容至50 mL.b.0.04 mol/L茚三酮溶液的配制：称取茚三酮0.356 3 g于50 mL离心管中，加25 mL水和0.014 3 g氯化亚锡(SnCl2)，微微加热使茚三酮溶解，放在暗处，静置过夜，过滤后定容至50 mL.c.配制不同pH的缓冲溶液：醋酸—醋酸钠缓冲液的pH分别为4.0、4.5、5.0、5.5,磷酸氢二钠—磷酸二氢钠缓冲液的pH分别为6.0、7.0.

1.3.2 丝氨酸—茚三酮反应及反应产物的光谱扫描 反应体系：准确量取0.02 mol/L丝氨酸标准溶液0.2 mL，pH值为6.0的缓冲溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，再加入1.0 mL的0.04 mol/L茚三酮溶液，定容至10 mL.混匀，取出混合液2 mL于10 mL具塞离心管中，加塞于沸水浴中反应一定时间，取出置冰水中迅速冷却至室温.将丝氨酸标准品与茚三酮反应后的产物在UV-240紫外扫描仪上扫描，寻找400 nm与700 nm之间的最大吸收波长.

1.3.3 显色反应条件的选择 为了研究丝氨酸与茚三酮反应的最佳条件，可改变1.3.2的反应体系中的单一因素，并以相应的空白值做对照，在最大吸收波长处测定吸光度，以确定反应的最佳相对用量和时间.

1.3.4 丝氨酸标准曲线的绘制 确定最佳茚三酮用量、最佳反应时间之后，控制丝氨酸标准溶液用量呈梯度变化，参照1.3.2的反应体系，测定吸光度，将吸光度对浓度进行直线回归，得丝氨酸标准曲线及方程.

1.3.5 标准曲线准确度的检测 取一定体积的已知浓度的溶液，分别加入pH值为4.5，5.0和6.0的缓冲溶液，按上述方法分别测定其吸光度，从标准曲线上的数学表达式中计算出丝氨酸的质量浓度，测三次取平均值.计算误差值.

2 结果与分析

2.1 丝氨酸—茚三酮反应产物的测定波长的测定

将丝氨酸标准品反应后的产物在UV-240紫外扫描仪上扫描，丝氨酸和茚三酮反应产物在570 nm处有最大吸收，故选择570 nm为测定波长.

2.2 单因素实验

2.2.1 丝氨酸与茚三酮相对用量的选择 取1.0 mL浓度为0.02 mol/L的丝氨酸标准溶液于一组10 mL的容量瓶，瓶中加入1.0 mL pH4.5的缓冲溶液，分别往瓶中加入0.6，0.8，1.0，1.2，1.5，1.6，1.8，2.0，2.2 mL 0.04 mol/L茚三酮溶液，参照1.3.2显色测定各显色体系的吸光度，结果如图所示.

图1 不同茚三酮用量对显色体系吸光度的影响

由图1可知，取0.02 mol/L丝氨酸标准溶液用量为1.0 mL，茚三酮用量小于1.5 mL(摩尔比3∶1)时，随着茚三酮用量的不断增加，吸光度值不断变大，当茚三酮用量为1.5 mL(摩尔比3∶1)时，吸光度接近最大值，从保证实验效果和节约显色剂用量的角度考虑，茚三酮与丝氨酸的摩尔比为3∶1时比较恰当.

2.2.2 反应时间和pH值的选择 取0.2 mL浓度为0.02 mol/L的丝氨酸标准溶液于一组容量瓶，向瓶中加入0.3 mL 0.04 mol/L 的茚三酮溶液，参照1.3.2显色，研究不同反应时间和不同pH值条件下的吸光度，结果如图2所示.

由图2A可知，反应时间30 min时有最大吸光度值.由图2B可知，pH值对丝氨酸与茚三酮的显色反应有极大的影响，且不同pH值对其影响的规律并不明显，这是因为在不同的pH值条件下，反应的机理并不相同，生成的有色物质也不一样[21-22].为了准确测定丝氨酸的含量，必须根据体系pH值的需要，测定不同pH值条件的丝氨酸含量的标准曲线.

A.不同反应时间

B.不同pH值条件

2.3 几种不同pH值条件下丝氨酸标准曲线的绘制

2.3.1 pH值为4.5的丝氨酸标准曲线 取一组10 mL的容量瓶，按表1依次加入0.02 mol/L丝氨酸标准溶液，各加入pH为4.5的缓冲溶液1.0 和1.5 mL茚三酮.在100 ℃条件下，反应30 min.按1.3.2方法测定吸光度.结果如表1所示.

表1 pH值为4.5时丝氨酸标准溶液数据

以标准丝氨酸质量浓度作横坐标，以吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线，求得其回归方程为y=5.595x+0.056，相关系数R2= 0.991 2.

图3 丝氨酸标准曲线(pH=4.5)

2.3.2 pH值为5.0时的丝氨酸标准曲线 取一组10 mL的容量瓶，按表2依次加入0.02 mol/L丝氨酸标准溶液，各加入pH为5.0的缓冲溶液1.0 mL和0.525 mL茚三酮，在100 ℃条件下，反应30 min.按1.3.2方法测定吸光度.结果如表2所示.

表2 pH值为5.0时丝氨酸标准曲线数据

以标准丝氨酸质量浓度作横坐标，以吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线，求得其回归方程为y=10.59x+0.023，相关系数R2=0.998 5.

图4 丝氨酸标准曲线(pH=5.0)

2.3.3 pH值为6.0时的丝氨酸标准曲线 取一组10 mL的容量瓶，按表2依次加入0.02 mol/L丝氨酸标准溶液，各加入pH为6.0的缓冲溶1.0和0.21 mL茚三酮.在100 ℃条件下，反应30 min.按1.3.2方法测定吸光度.结果如表3所示.

表3 pH值为6.0时丝氨酸标准曲线数据

以标准丝氨酸质量浓度作横坐标，以吸光度值作纵坐标，绘制标准曲线，求得其回归方程为y=37.824x+0.003 3，相关系数R2=0.991 5.

图5 丝氨酸标准曲线(pH=6.0)

2.4 方法准确度的检测

配制浓度为0.01 mol/L的丝氨酸的标准溶液10 mL，分别用移液枪准确量取体积为200 uL的溶液三份，放入标号为1，2，3的三只10 mL的容量瓶中，据相对摩尔比为(3∶1)的比例，各加入0.02 mol/L的茚三酮溶液280 uL，然后依次加入500 uL，pH值分别为4.5，5.0和6.0的缓冲溶液，依1.3.2试验步骤，测定三只容量瓶里溶液反应后的吸光度，结果如表4所示.

表4 丝氨酸标准曲线准确度的检测

3 结 语

用酶标仪分光光度法确定了丝氨酸与茚三酮显色反应的最佳时间为30 min和相对摩尔比为1∶3，反应的温度为100 ℃.据丝氨酸磷脂制备体系反应后测定丝氨酸含量的需要，笔者还测定了pH值分别为4.5，5.0和6.0时的丝氨酸标准曲线.pH值为4.5时，y=5.595x+0.056 (R2=0.991 2)；pH值为5.0时，y=10.59x+0.023(R2=0.998 5)；pH值为6.0时，y=37.388x+0.005 2(R2=0.991 5)，用已知质量浓度的丝氨酸标准溶液对标准曲线的准确度进行检测，误差范围为-6.26%～+3.78%.应用茚三酮—分光光度法测定由卵磷脂制备丝氨酸磷脂体系中的丝氨酸质量浓度时，操作简便，结果准确，节约成本，重复性好.

参考文献：

[1]Scholl-burgi S, Heinz-erian P. Amino acid cerebrospinal fluid/plasma ratios in children: influence of age, gender, and antiepileptic medication[J]. Pediatrics, 2008(4): 920-926.

[2]Karakecili A G, Demirtas T T. Evaluation of L929 fibroblast attachment and proliferation on Arg-Gly-Asp-Ser (RGDS)-immobilized chitosan in serum-containing/serum-free cultures[J]. J Biosci Bioeng,2007(1): 69-77.

[3]Jones C M, Smith M. Reference data for cerebrospinal fluid and the utility of amino acid measurement for the diagnosis of inborn errors of metabolism[J]. Ann Clin Biochem, 2006, 43：63-66.

[4]Manso Filho H C, Mckeever K H, Gordon M E, et al. Developmental changes in the concentrations of glutamine and other amino acids in plasma and skeletal muscle of the Standardbred foal.[J]. Anim Sci, 2009(03)：23-29.

[5]Yin Z, Albrecht J, Syversen, et al. Comparison of alterations in amino acids content in cultured astrocytes or neurons exposed to methylmercury separately or in co-culture[J]. Neurochem Int, 2009, 55(1-3): 136-42.

[6]傅莉，刘信洪，徐春艳，等. HPLC法监测DL-丝氨酸的合成研究[J]. 北京化工大学学报:自然科学版，2003(4)：105-108.

[7]Tsiao H Y, Wei T. Enzymatic prA570uction of L-Serine[J]. Biotech and Bioeng, 1996(28): 857-867.

[8]Kubota H. Fermentation of L-serine from Glycine byCorynebacterium glycinophilum. [J]. Gen. Appl. Microbiol, 1992(18): 365-37.

[9]Heptner G, Domschke. Amino acid level in plasma--expressed as alpha-amino-nitrogen reaction to stimulation of the exocrine pancreas: approaches to a new pancreatic function test. Klin Wochenschr，1987, 65: 1054-1061.

[10]王雅琴，李绪昆. 采用氨基酸自动分析仪测定黄酒中的游离氨基酸[J].食品与发酵工程，2005(4)：23-25.

[11]王薇，立周. 分光光读法测定生物转化体系中的L-丝氨酸[J]. 江苏食品发酵，2008(1)：43-46.

[12]周圆圆，朱敏，王磊，等. 变色酸-分光光度法测定丝氨酸含量[J]. 氨基酸和生物资源，2007(1)：73-76.

[13]魏东，谭慧林，杨海燕. L-丝氨酸高产菌株的选育和摇瓶发酵条件优化[J]. 氨基酸和生物资源，2006，28(1): 46-48.

[14]高伟, 张伟国. L-丝氨酸产生菌的选育与发酵条件的初步研究[J]. 发酵科技通讯，2007，36(2): 12-15.

[15]欧倩，韦东，武波. 丝氨酸生产菌的筛选及静息细胞培养系统中L-丝氨酸的合成[J]. 氨基酸和生物资源，2006，28(3): 41-44.

[16]陈忠云. α-氨基酸与茚三酮显色反应机理研究[J].化学与生物工程，2004(6)：1-3.

[17]钱和，郝刚. L-精氨酸高产菌的育选育[J]. 微生物学通报，2005，32(3): 46-50.

[18]卢发，张伟国. 纸层析-分光光度法测定发酵液中L-丝氨酸和甘氨酸的含量[J]. 食品与发酵工业，2007，31(3)：119-121.

[19]Zerweck J, Masch A, Schut kowski M, et al. Peptide microarrays for profiling of mA570ification state-specific antibA570ies[J]. MethA570s Mol Biol，2009, 24: 169-180.

[20]Stabler T V, Byers S S, Zura R D, et al. Amino acid racemization reveals differential protein turnover in osteoarthritic articular and meniscal cartilage[J]. S Arthritis Res Ther，2009(2): 34-37.

[21]陈忠云. α-氨基酸与茚三酮显色反应机理研究[J]. 化学与生物工程，2002(6)：11-13.

[22]张振华. α-氨基酸与茚三酮显色反应影响因素的探究[J]. 邵阳师范学报，2003(1)：19-22.