贲门癌组织中Ebp1 mRNA的表达及其临床意义

崔玲玲 李春阳 王旗 马素好 陈幕华 吕全军陈萍萍 谢东 李文杰

1.郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，河南 郑州450001；2.郑州澍青医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室，河南 郑州450064

贲门癌组织中Ebp1 mRNA的表达及其临床意义

崔玲玲1李春阳1王旗1马素好2陈幕华1吕全军1陈萍萍1谢东1李文杰1

1.郑州大学公共卫生学院营养与食品卫生学教研室，河南 郑州450001；2.郑州澍青医学高等专科学校病原生物学与免疫学教研室，河南 郑州450064

背景与目的：Ebp1是近年发现的一种新型蛋白质，为表皮生长因子受体ErbB-3胞内近膜区结合蛋白，影响细胞增殖与分化。本研究旨在探讨人贲门癌组织中Ebp1 mRNA表达及其与临床参数的关系。方法：采用实时荧光定量PCR对120例贲门癌患者的癌组织和癌旁至少5 cm处的正常贲门组织Ebp1 mRNA的表达水平进行测定。结果：73（60.83%）例贲门癌样本中Ebp1 mRNA表达下调，单因素分析显示，与贲门癌中Ebp1 mRNA的表达高度相关的临床参数包括年龄、淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、病理分级和临床分期。多因素分析显示，年龄、家族史、肿瘤体积、病理分级及临床分期均是Ebp1表达的保护因素，而性别是Ebp1 mRNA表达的危险因素，即女性中Ebp1 mRNA表达高于男性。结论：Ebp1在贲门癌发展过程中起重要作用，可作为贲门癌病情进展的监测、转移潜能及预后评估方面的一个靶基因。

Ebp1； 贲门癌； 实时荧光定量PCR

Ebp1是近年发现的一种新型蛋白质，为表皮生长因子受体ErbB-3胞内近膜区结合蛋白，是增殖相关PA2G4家族中的一员，与细胞周期、蛋白质转录翻译相关，参与多个信号传导通路，影响细胞增殖和分化［1］。本研究采用实时荧光定量PCR分析Ebp1基因在贲门癌原发灶及其配对的癌旁正常贲门组织（距癌>5 cm）中的mRNA水平及与临床病理参数的关系，以探讨其临床意义。

1 资料和方法

1.1 样本采集 选取2005—2006年于郑州大学第一附属医院和林州市肿瘤医院就医的贲门癌患者作为研究对象，得到医院和患者同意后，采集手术后患者贲门癌原发灶及癌旁>5 cm处正常贲门组织有效标本120对。肿瘤标本和配对的正常组织标本均通过组织学诊断，以具有贲门癌原发灶及配对正常贲门组织标本作为有效标本。标本离体后立即放在液氮罐中，后转移到-80 ℃冰箱中冷冻保存。收集患者相关临床资料。

1.2 仪器与试剂 实时荧光定量PCR仪（Stratagene Mx3000P，Genetimes Technology，Inc.） ；TRIzol 试剂（美国Invitrogen公司）；AMV逆转录系统（美国Promega公司）；荧光定量PCR试剂盒（德国Roche诊断有限公司）。1.3 RNA提取和cDNA合成 使用TRIzol试剂盒从贲门癌标本中提取完整的RNA，通过1%的琼脂糖凝胶电泳及RNA的A值评估RNA含量和纯度。在紫外光下可见18 S和28 S RNA条带。用50 μL SuPerscriPt Ⅱ试剂将2 μg RNA逆转录成cDNA。

1.4 实时荧光定量PCR的理论基础 参数循环阈值（Cycle threshold），简称Ct，是指产生的荧光量超过一个固定的阈值时的循环次数。通过制作标准曲线对实验进行质量控制，用内参基因β-actin对RNA含量的变异进行较正。△NCt = （CtNormalEbp1-CtNormalβ-actin），△CCt =（CtCancerEbp1-Ctcancerβ-actin），△△Ct =△NCt-△CCt，以扩增倍数作为结果，扩增倍数=2△△Ct。

1.5 β-actin、Ebp1引物设计 采用 Primer Premier 5.0软件设计基因引物，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表 1 实时荧光定量PCR引物序列Tab. 1 Oligonucleotide primer used for real time -PCR

1.6 实时荧光定量PCR 将cDNA 1∶20稀释后作为PCR模板，反应体积为15 μL，所有的反应都在PCR仪上重复3次，95 ℃ 3 min，95 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，然后72 ℃延伸30 s，84 ℃ 15 s采集荧光，40个循环，最后在72 ℃温度下延伸7 min。

1.7 统计处理 试验结果输入SPSS 12.0软件，扩增倍数取以2为底对数转换后，经正态性检验数据呈正态分布，Δ（ΔCt）≥-1定义为阳性，Δ（ΔCt）<-1定义为阴性。采用配对t检验和χ2检验进行统计分析，以α=0.05作为检验水准，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 实时荧光定量PCR结果 采用Mx3000P软件分析实时荧光定量PCR的扩增曲线和熔解曲线，扩增曲线拐点清楚，整体平行性好，基线平而无上扬现象，熔解曲线产物峰特异（图1）。

2.2 Ebp1在贲门癌组织中的表达水平 在120例贲门癌样品中，Ebp1在73例（60.83%）中 表达下调（图2）。配对t检验显示：Ebp1基因的mRNA的表达在贲门癌组织中与配对的正常贲门组织中差异有统计学意义（t=3.534，P=0.000）。

表 2 Ebp1的表达水平与临床参数的关系Tab. 2 Correlation between the Ebp1 mRNA expression levels and the clinical-pathologic variable(n)

2.3 Ebp1的表达水平与临床参数的单因素分析 单变量分析显示：Ebp1 mRNA的表达与贲门癌的临床参数高度相关，包括年龄、淋巴结转移、家族史、肿瘤体积、病理分级和临床分期。不同年龄组间Ebp1 mRNA表达水平差异有统计学意义（χ2=7.654，P=0.022）；淋巴结转移组Ebp1 mRNA表达水平显著低于淋巴结未转移组（χ2=10.457，P=0.001）；有家族史组Ebp1 mRNA表达水平显著低于无家族史组（χ2=28.096，P=0.000）；肿瘤体积越大，病理分级越高，临床分期越高，则Ebp1 mRNA表达水平均越低，各组间差异均有统计学意义（χ2=8.567，P=0.014；χ2=21.690，P=0.000；χ2=14.042，P=0.001）；而性别、浸润深度和病理类型与Ebp1 mRNA的表达之间差异无统计学意义（表2）。

2.4 Ebp1表达水平与临床参数的多因素分析 将各因素引入非条件Logistic回归分析模型进行多因素分析，结果表明：年龄、家族史、肿瘤体积、病理分级和临床分期均是Ebp1表达的保护因素，95%CI分别为0.324（0.140~0.752）、0.032（0.005 ~ 0.193）、0.514（0.274 ~ 0.965）、0.229（0.078~0.669）、0.254（0.097~0.669），即年龄越大，有家族史，病理分级越高，临床分期越高，则Ebp1 mRNA表达越低。而性别是Ebp1 mRNA表达的危险因素，95%CI为5.113（1.241~21.059），即女性中Ebp1 mRNA表达比男性高（表3）。

3 讨 论

Ebp1是新发现的一种ErbB-3胞内结合蛋白，ErbB-3是表皮生长因子家族中的重要成员。在外界刺激作用下Ebp1与ErbB-3分离到达细胞核内，异位表达可抑制ErbB-2/ErbB-3阳性表达的乳腺癌、前列腺癌细胞的生长增殖并诱导细胞分化［2-3］。有研究［4-5］发现Ebp1抑制细胞增殖的能力与其调控细胞周期相关基因有关。也有研究［6］发现在口腔鳞状细胞癌Tca 8113中共表达ErbB-2/ErbB-3，转染Ebp1基因到该细胞中，能明显抑制其生长、分裂和增殖水平，表明肿瘤细胞在体外的生长增殖受到明显抑制。还有研究［7］发现在腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞中共表达ErbB-2/ErbB-3，转染Ebp1基因到该细胞中，细胞在体外的生长增殖受到明显抑制。本研究结果中贲门癌组织中Ebp1基因表达水平与正常配对贲门组织相比，其表达水平显著下调，提示Ebp1能抑制肿瘤细胞的生长。与上述在细胞中的结果相一致。

单因素分析显示：Ebp1 mRNA的表达与贲门癌的临床参数高度相关，包括年龄、家族史、淋巴结转移、肿瘤体积、肿瘤分级和临床分期。其中淋巴结转移组Ebp1的表达水平与未转移组差异有统计学意义，淋巴结转移组Ebp1表达水平阴性者比阳性者多，提示Ebp1有抑制肿瘤细胞转移的作用。有研究［7-8］表明，腺样囊性癌细胞系ACC-M细胞中共表达ErbB-2/ErbB-3，转染Ebp1 基因到该细胞中，细胞在体外的增殖和生长受到明显抑制，细胞周期也发生变化，侵袭能力减弱，发生转移的能力也降低。这与本研究的结果相吻合。多因素结果也显示年龄、家族史、肿瘤体积、病理分级和临床分期均是Ebp1表达的保护因素，与单因素结果基本一致，但是未显示淋巴结转移与Ebp1表达水平的关系，这有待于进一步研究。

综上所述，Ebp1在贲门组织中的低表达，与肿瘤的恶性生物学行为及肿瘤细胞的分化不良有关，可能在肿瘤的发生发展中起重要作用，可作为贲门癌发生发展的一个预示指标，并可作为一种新的治疗肿瘤的基因作用靶点。

表 3 Ebp1表达水平与临床参数的多因素Logistic回归分析Tab. 3 Multiple factor Logistic regression of Ebp1 mRNA expression levels with clinical-pathologic variable

［1］Lamartine J, Seri M, Cinti R, et al. Molecular cloning and mapping of a human cDNA (PA2G4) that encodes a protein highly homologous to the mouse cell cycle protein p38-2G4［J］. Cytogenet Cell Genet, 1997, 78(1): 31-35.

［2］Zhang Y, Fondell JD, Wang Q, et al. Repression of androgen receptor mediated transcription by the ErbB-3 binding protein, Ebp1［J］. Oncogene, 2002, 21 (36): 5609-5618.

［3］Lessor TJ, Yoo JY, Xia X, et al. Ectopic expression of the ErbB-3 binding protein Ebp1 inhibits growth and induces differentiation of human breast cancer cell lines［J］. J Cell Physiol, 2000, 183(3): 321-329.

［4］Zhang Y, Woodford N, Xia X, et al. Repression of E2F1-mediated transcription by the ErbB3 binding protein Ebp1 involves histonedeacetylases［J］. Nucleic Acids Res, 2003,31(8 ): 2168-2177.

［5］Lessor TJ, Hamburger AW. Regulation of the ErbB3 binding protein Ebp1 by protein kinase C［J］. Mol Cell Endocrinol,2001, 175(1-2): 185-191.

［6］余优成,张志愿,陈万涛,等.ErbB-3结合蛋白-Ebp1对ACC2M细胞生长的影响［J］.中国临床医学,2005, 12(2):324-326.

［7］余优成,张志愿,陈万涛,等. ErbB-3结合蛋白 Ebp1 Tca 8113细胞生长增殖的影响［J］. 上海第二医科大学学报,2005, 12(2): 334-355.

［8］Yu YC, Chen WT, Zhang ZX, et al. Suppression of salivary adenoid cystic carcinoma growth and metastasis by ErbB3 binding protein Ebp1 gene transfer［J］. Inter J Cancer,2007, 120(9): 1909-1913.

Expression of Ebp1 mRNA in human cardiac cancer tissues and its clinical significance

CUI Ling-ling,LI Chun-yang,WANG Qi,MA Su-hao,CHEN Mu-hua,LV Quan-jun,CHEN Ping-ping,XIE Dong,LI Wen-jie(Nutrition and Food Hygiene, College of Public Health,Zhengzhou University,Zhengzhou Henan 450001,China)

LI Wen-jie E-mail：lwj@zzu.edu.cn

Background and purpose：Ebp1 is a new type of protein which can interact with cytoplasmic domain of the ErbB-3 receptor and may contribute to transduction growth regulatory signals. This protein has been implicated in growth inhibition and the induction of differentiation of human cancer cells. In this study, we investigated Ebp1 mRNA expression levels and their relations to clinical and pathological features in human cardiac cancer.Methods：We quantified Ebp1 expression levels in 120 cardiac cancer tissues and their matched normal cardiac tissues by using real-time PCR assay.Results：Seventy-three (60.83%) samples showed down-regulation of Ebp1 in cardiac cancer as compared with the matched normal cardiac tissues. The univariate analysis showed that the Ebp1 mRNA expression levels had significant association with age, metastasis, family history, tumor size and TNM stage.The multiple factor analysis showed that age, family history, tumor size, pathological grading and TNM stage were protective factors for Ebp1 in cardiac cancer. But gender was a risk factor because the Ebp1 mRNA levels in females were higher than in males.Conclusion：Ebp1 plays an important role in the procession of cardiac cancer and may serve as a valuable target in monitoring cardiac disease, metastatic potential and prognosis.

Ebp1; cardiac cancer; real-time PCR

R73-35+4

A

1007-3639(2010)04-0265-05

国家自然科学基金资助项目(30725010)。

李文杰 E-mail:lwj@zzu.edu.cn

2009-09-17

2010-01-08）