活性氧在EGCG诱导人胃癌MGC803细胞凋亡中的作用

邹少娜 林敏 伍石华 王化修 罗招阳

1.邵阳医学高等专科学校病理教研室，湖南 邵阳 422000；2. 邵阳医学高等专科学校附属医院内科，湖南 邵阳 422000；3. 南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001

活性氧在EGCG诱导人胃癌MGC803细胞凋亡中的作用

邹少娜1林敏2伍石华1王化修1罗招阳3

1.邵阳医学高等专科学校病理教研室，湖南 邵阳 422000；2. 邵阳医学高等专科学校附属医院内科，湖南 邵阳 422000；3. 南华大学肿瘤研究所，湖南 衡阳 421001

背景与目的：表没食子儿茶素没食子酸（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）抗肿瘤作用的机制目前尚不十分清楚，本研究旨在探讨活性氧（reactive oxygen species，ROS）在EGCG诱导人胃癌MGC803细胞凋亡中的作用。方法：采用噻唑蓝比色法（MTT）检测MGC803细胞的存活率；采用荧光显微镜观察MGC803细胞的凋亡率；流式细胞术检测MGC803细胞凋亡率及细胞内活性氧水平。结果：EGCG可诱导MGC803细胞凋亡，细胞内活性氧水平升高。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（N-acetyl-L-cystein，NAC）干预后，EGCG抑制MGC803细胞生长的作用明显减弱，细胞凋亡率下降，NAC抑制了细胞内活性氧水平的升高。结论：EGCG可诱导MGC803细胞凋亡，该作用可被NAC显著抑制，提示EGCG诱导MGC803细胞凋亡与细胞内活性氧产生增加有关。

胃肿瘤； 表没食子儿茶素没食子酸酯； 活性氧； 细胞凋亡

细胞凋亡在肿瘤的发生和发展过程中起着非常重要的作用，诱导肿瘤细胞凋亡是各种抗癌药物发挥作用的共同途径之一。表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）是绿茶中含量最为丰富的茶多酚，且活性最强，被认为是21世纪最具有应用前途的抗氧化剂和抗癌药物之一［1］。研究表明，EGCG可在体内外抑制多种肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡［2-5］，但作用机制尚不十分明确。胃癌是常见的恶性肿瘤之一，化学治疗在胃癌治疗中占有很重要的地位，但存在一定的不良反应和耐药性。

活性氧（reactive oxygen species，ROS）是体内存在的一类氧的单电子还原产物，包括超氧阴离子过氧化氢、羟基和自由基等。在许多诱导剂诱导实验中ROS水平的激增已被证实是引起细胞凋亡的重要途径之一，其变化甚至早于细胞凋亡形态学改变［6］。

本实验室前期研究表明，EGCG可能通过激活p38MAPK通路使部分人胃癌MGC803细胞凋亡［7］。本研究在此基础上，进一步探讨ROS在EGCG诱导人胃癌MGC803细胞凋亡中的作用。为EGCG应用于胃癌的临床治疗提供依据。

1 材料和方法

1.1 细胞及细胞培养 人胃低分化黏液腺癌细胞MGC803，由中南大学湘雅医学院细胞中心引进。用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养液，在37 ℃、CO2体积分数为5%且饱和湿度的培养箱内培养传代。

1.2 药品与试剂 EGCG为Sigma公司产品，纯度95%；小牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；MTT为Amresco公司产品；吖啶橙、溴化乙锭为美国Sigma公司产品，使用终质量浓度为100 μg/mL PBS，4 ℃避光保存；2’,7’-二氯氢化荧光素二脂(2’, 7’-Dichlorofluorescin diacetate，DCFH-DA)，N-乙酰-L-半胱氨酸（NAcetyl-L-cysteine，NAC）购自Sigma公司。

1.3 MTT比色法测定 取对数生长期细胞，接种于96孔板，每孔180 μL（含0.9×104细胞），培养6 h后处理细胞，实验分为4组：空白对照组；10 μmol/L NAC组；120 μmol/L EGCG组（通过前期的研究表明，此浓度对MGC803细胞生长抑制效应稳定）；10 μmol/L NAC加120 μmol/L EGCG组。继续培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，再培养4 h后小心吸去全部上清液，每孔加入200 μL二甲基亚砜，振荡摇匀，使结晶充分溶解。置酶联免疫仪上在570 nm波长处测各孔吸光度（A）值，按下列公式计算抑制率（inhibitory rate，IR）：IR=（1-A处理组平均值/A对照组平均值）×100%。

1.4 荧光显微镜观察 不同药物（分组同MTT比色法）处理MGC803细胞24 h后收集细胞，用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，取95 μL的细胞悬液，加入5 μL的吖啶橙/溴化乙锭贮存液混匀。吸一滴混合液点在洁净玻片上，直接用盖玻片封片，置于荧光显微镜下观察并照相，分别计数凋亡细胞。细胞凋亡指数（%）=［（早期凋亡细胞＋晚期凋亡细胞）/全部细胞 ］×100%。实验重复3次。

1.5 PI染色流式细胞术分析 不同药物（分组同MTT比色法）处理MGC803细胞24 h后收集细胞，用4 ℃ 70%乙醇溶液固定，-20 ℃冰箱保存。检测前用PBS洗涤细胞3次，加RNA酶消化，碘化丙啶染色，流式细胞仪（型号为FACS420）测定，分析凋亡率。

1.6 细胞内ROS含量的检测 DCFH-DA是一种自身不产生荧光的化合物，它能自由地通过细胞膜，在细胞内被ROS氧化为 2’，7’-二氯荧光素 (dichlorofluorescein, DCF)。DCF能发出很强的荧光，采用流式细胞仪检测出的荧光强度间接反映了细胞内ROS水平，并呈现出正相关性。

药物处理MGC803细胞后收集细胞，参照文献［8］方法，采用流式细胞仪测定细胞内ROS水平。用Hank’s液洗涤细胞2次，加入400 μL终浓度为10 μmol/L的DCFH-DA，充分混匀，在37 ℃条件下避光反应50 min，用Hank’s液洗涤细胞3次以去除细胞外荧光剂，用500 μL Hank’s液重悬细胞，37 ℃条件下水浴10 min．流式细胞仪分析荧光强度，激发波长488 nm，发射波长530 nm。

1.7 统计处理 结果采用表示，数据采用SPSS 11.0软件进行统计学分析，组间比较用单因素方差（One-way ANOVA）分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 MTT比色法测定细胞活性 MTT比色法测定结果表明，10 μmol/L NAC单独使用时无明显抑制MGC803细胞增殖的作用(P>0.05)；120 μmol/L EGCG对MGC803细胞的抑制率为61.30 %（P＜0.05），而与NAC合用后，能减弱EGCG的抑制作用，使抑制率从61.30%降到34.50%（P<0.05）。

2.2 荧光显微镜观察细胞凋亡 荧光显微镜下观察MGC803细胞发生凋亡的个数，计算细胞凋亡指数。结果表明，10 μmol/ L NAC单独使用对MGC803细胞 ［细胞凋亡指数为（2.02±0.48）%］，没有明显影响 ［对照组细胞凋亡指数为（1.94±0.36）%］（P＞0.05），120 μmol/ L EGCG处理MGC803细胞48 h后，细胞凋亡指数为（26.70±3.82）%，明显高于对照组（P＜0.05）。但与NAC合用后细胞凋亡指数下降到（15.24±1.80）%（P＜0.05）（图1）。荧光显微镜下观察发现，经EGCG处理后的MGC803细胞皱缩呈圆形，细胞质、细胞核呈红色，且细胞核皱缩或碎裂。

2.3 PI染色流式细胞术分析 流式细胞术检测结果显示：10 μmol/L NAC单独使用对MGC803细胞的凋亡率无显著影响［凋亡率为（1.9±0.08）%，P＞0.05］，120 μmol/L EGCG处理MGC803细胞24 h后，细胞凋亡率为21.50±1.80%，明显高于对照组［凋亡率为（1.30±0.10）%，P＜0.05］，出现Sub-G1峰，说明EGCG具有诱导MGC803细胞凋亡的作用。但与N A C合用后细胞凋亡率下降到（16.8±1.64）%（P＜0.05，图2）。

2.4 细胞内活性氧检测 120 μmol/L EGCG分别处理MGC803细胞1、6、12和24 h后，细胞内荧光强度分别为23.72±2.30、62.10±4.50、53.80±3.50和40.20±4.20，与对照组 7.80±0.12 相比，各组均高于其荧光强度（P<0.05）。10 μmol/L NAC单独使用对 MGC803细胞内 ROS水平没有明显影响，但与EGCG合用后，检测荧光值为25.50±2.30，能抑制EGCG处理后MGC803细胞的ROS水平（P<0.05）。

3 讨 论

ROS是氧代谢过程中产生的一些中间产物，具有高度的化学活性，其对于细胞增殖分化凋亡的调控、胚胎的正常发育和机体的稳态调节具有重要的意义。目前研究发现，一些抗癌药物如顺铂、紫杉醇和三氧化二砷等在诱导肿瘤细胞分化、凋亡的过程中，均可检测到细胞内ROS明显的增高［9-10］。

本研究检测了抗氧化剂NAC，在EGCG抑制MGC803细胞生长和促进其凋亡中的作用。流式细胞仪检测表明，EGCG能够持续激活ROS。MTT比色法、荧光显微镜观察、流式细胞术分析结果证明，用NAC抑制 ROS 的活性后，EGCG引起的细胞生长抑制、诱导凋亡作用均被减弱。提示EGCG诱导MGC803细胞凋亡与细胞内 ROS 产生增加有关。此实验结果与以往文献相符［11-12］。EGCG使MGC803细胞 ROS水平升高的具体作用机制目前尚不清楚。

本实验结果显示，随着EGCG作用MGC803细胞，细胞内 ROS 含量增加，提示EGCG可通过 ROS 增加诱导细胞凋亡。本实验还提示，虽然通过抗氧化剂 NAC可以逆转EGCG的凋亡诱导作用，但这种逆转作用不是完全的。因此细胞内 ROS 产生增加不是EGCG诱导MGC803细胞凋亡的唯一机制，可能还有其它机制参与了作用，需进一步研究。总之，EGCG抑制MGC803细胞生长，促进MGC803细胞凋亡的作用与细胞内 ROS 产生增加有关。

［1］Zhivotovsky B, Orrenius S. Carcinogenesis and apoptosis paradigms and paradoxes［J］. Carcinogenesis, 2006, 27(10):1939-1945.

［2］Qanungo S, Das M, Haldar S, et al. Epigallocatechin-3-gallate induces mitochondrial membrane depolarization and caspase-dependent apoptosis in pancreatic cancer cells［J］.Carcinogenesis, 2005, 26(5): 958-967.

［3］Noguchi M, Yokoyama M, Watanabe S, et al. Inhibitory effect of the tea polyphenol, (-)-epigallocatechin gallate, on growth of cervical adenocarcinoma cell lines［J］. Cancer Lett,2006, 234(2): 135-142.

［4］Stuart EC, Scandlyn MJ, Rosengren RJ. Role of epigallocatechin gallate (EGCG) in the treatment of breast and prostate cancer［J］. Life Sci, 2006, 79(25): 2329-2336.

［5］Horie N, Hirabayashi N, Takahashi Y, et al. Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric carcinoma cells［J］. Biol Pharm Bull, 2005, 28(4):574-579.

［6］Lau AT, Wang Y, Chiu JF. Reactive oxygen species: current knowledge and applications in cancer research and therapeutic［J］. J cell Biochem, 2008, 104 (2): 657-667.

［7］邹少娜, 林敏, 王化修, 等. P38MAPK在EGCG诱导人胃癌MGC-803细胞凋亡中的作用［J］. 肿瘤, 2008, 28 (9):763-766.

［8］江颖娟, 曾耀英, 王通, 等. 喜树碱诱导Jurkat细胞线粒体膜电势和线粒体质量变化的研究［J］. 中国病理生理杂志,2006, 22 (5): 846-850.

［9］蔡先彬, 荆绪斌, 胡辉, 等. 活性氧在顺铂诱导食管癌细胞EC-109凋亡中的作用［J］. 癌症, 2006, 25(4): 427-431.

［10］Woo SH, Park IC, Park MJ, et al. Arsenic trioxide sensitizes CD95/Fas-induced apoptosis through ROS-mediated upregulation of CD95/Fas by NF-kappaB activation［J］. Int J Cancer, 2004, 112(4): 596-606.

［11］Amann B, Hanson MS, Hatch E, et al. Quantification of basal and stimulated ROS levels as predictors of islet potency and function［J］. Am J Transplant, 2007, 7(1): 38-47.

［12］Fuchs TA, Abed U, Goosmann C, et al. Novel cell death program leads to neutrophil extracellular traps ［J］. J Cell Biol, 2007, 176(2): 231-241.

The role of reactive oxygen species in epigallocatechin-3-gallate-induced apoptosis of human gastric cancer MGC803 cells

ZOU Shao-na,LIN Min,WU Shi-hua,WANG Hua-xiu,LUO Zhao-yang(Department of Pathology, Shaoyang Medical College, Shaoyang Hunan 422000, China)

LUO Zhao-yang E-mail：hylzy2008@126.com

Background and purpose：Anticancer mechanism of epigallocatechin-3-gallate (EGCG) remains unclear. This study investigated the role of reactive oxygen species (ROS) in epigallocatechin-3-gallate (EGCG)-induced apoptosis in human gastric cancer MGC803 cells.Methods：The inhibition of MGC803 cells growth was measured by MTT assay. Apoptosis of MGC803 cells was studied by using the AO/EB fl uorescence stain. Flow cytometry was used to detect the intracellular ROS level and the rate of apoptosis.Results：EGCG could induce apoptosis of MGC803 cells and increased in the intracellular ROS level. However, after treatment with N-acetyl-L-cystein and an athiolcontaining antioxidant, the inhibitory effect of EGCG on MGC803 cells was significantly weakened. The apoptotic rate of the cells and the activity of the intracellular ROS level also decreased dramatically.Conclusion：EGCG can induce apoptosis of MGC803 cells. In turn, the ROS inhibitor can significantly inhibit the apoptosis induced by EGCG in MGC803 cells. These results suggest that the cellular generation of ROS plays a role in initiating EGCG-mediated apoptosis of MGC803 cells.

stomach neoplasms; epigallocatechin-3-gallate; reactive oxygen species; apoptosis

R73-36+1；R735.2

A

1007-3639(2010)05-0344-04

邵阳医学高等专科学校校级课题（项目编号：XK200808）。

罗招阳 E-mail:hylzy2008@126.com

book=334477,ebook=351

2010-01-12

2010-04-12）