金荞麦片质量标准的实验研究

2010-05-26何美珊钱炳辉王兆龙王志勇闫玉梅

中成药 2010年5期

何美珊，钱炳辉，王兆龙，王志勇，闫玉梅

（1.南通精华制药股份有限公司，江苏南通 226005;2.上海华氏大药房有限公司，上海 200082;3.江苏飞马药业有限公司，江苏南通 226009）

金荞麦片为单方浸膏片，是国家基本药物、国家中药保护品种，具有清热解毒、排脓祛瘀、祛痰止咳平喘的功能，用于急性肺脓疡、急慢性气管炎、支气管哮喘及细菌性痢疾。金荞麦片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册［1］，以薄层色谱法鉴别金荞麦、紫外分光光度法测定总黄酮含量。为有效控制金荞麦片的质量，改进鉴别与含量测定方法，薄层色谱主斑点为（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2，用HPLC法测定（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的含量。

1 仪器、试药与样品

1.1 仪器 Waters 600E高效液相色谱仪、2487双波长紫外检测器、Millennium32色谱管理系统，Varian cary 50 conc紫外-可见分光光度计，sartorius BP211D电子天平，pHS-25型pH计（上海雷磁仪器厂）。SB5200超声波清洗器（上海必能信超声有限公司），Model-3旋转蒸发器（上海医械专机厂），800型离心机（上海手术器械厂）。D1810C自动双重纯水蒸馏器（上海玻璃仪器公司、上海申科机械研究所合作出品）。

1.2 试药与样品柱层析用聚酰胺30～60目，批号F20020709，中国医药（集团）上海化学试剂公司;薄层层析用硅胶G，青岛海洋化工厂;乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为去离子双蒸水。

（-）-表儿茶素对照品，批号878-200102，中国药品生物制品检定所提供，高效液相色谱归一化法测定其含量为98.4%。原矢车菊素B2对照品，批号Ky020644BB，日本フナュツ株色会社提供，高效液相色谱归一化法测定其含量为95.6%。金荞麦对照药材，批号1114-200001，中国药品生物制品检定所提供。金荞麦片供试品，薄膜衣片，南通精华制药有限公司生产。

2 薄层色谱鉴别

取3.2.2项下供试品溶液5 mL，减压浓缩至干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为供试品溶液。取缺金荞麦的阴性制剂，同法制成阴性对照液。另取金荞麦对照药材1 g，加稀乙醇30 mL，置水浴上回流1 h，滤过，滤液减压浓缩至1～2 mL，移置10 mL具塞试管中，加乙腈-水（1∶9）至约10 mL，摇匀，离心（3 000 r/min）5 min，取上清液，照3.3.2项供试品溶液的制备项下自“加入聚酰胺柱……”起，依法收集洗脱液，减压浓缩（50～60℃）至干，残渣加乙醇1 mL使溶解，作为对照药材溶液。再取（-）-表儿茶素对照品、原矢车菊素B2对照品，分别加乙醇制成每1 mL含0.4 mg的溶液，作为对照品溶液。照薄层色谱法（中国药典2005年版一部附录ⅥB）试验，吸取上述5种溶液各5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（1∶2∶0.2∶0.1）为展开剂，展开7.2 cm，取出，晾干，喷以25%磷钼酸乙醇溶液，在110℃加热约2 min至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

3 含量测定

3.1 色谱条件与系统适用性试验 Symmetry C18色谱柱，5 μm，3.9 mm id ×150 mm。流动相:水（用磷酸调pH值至3.00±0.02）-乙腈（92∶8）。流速:0.8 mL/min，检测波长:280 nm，柱温:35℃，进样量10 μL。色谱柱理论板数按（-）-表儿茶素峰计算应不低于8 000。

3.2 溶液的制备

3.2.1 对照品溶液的制备取（-）-表儿茶素对照品适量，精密称定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含（-）-表儿茶素23.9 μg的对照品溶液。取原矢车菊素B2对照品适量，精密称定，加乙腈-水（1∶9）制成每1 mL含原矢车菊素B234.4 μg的对照品溶液。

3.2.2 供试品溶液的制备取本品20片，精密称定，研细，取1 g，精密称定，置25 mL量瓶中，精密加入乙腈-水（1∶9）25 mL，摇散，称定重量，超声处理（功率160 W，频率50 KHz）30 min，放冷，再称定重量，用乙腈-水（1∶9）补充减失的重量，摇匀，离心（3 000 r/min）5 min，精密量取上清液10 mL，加入聚酰胺柱（30～60目，3 g，内径1.0 cm，湿法装柱），用水30 mL洗脱，弃去水液，再加乙醇150 mL洗脱，收集洗脱液，减压浓缩（50～55℃）至近干，加乙腈-水（1∶9）溶解并转移至10 mL量瓶中，加乙腈-水（1∶9）至刻度，摇匀，用微孔滤膜（0.45 μm）滤过，取续滤液，即得。

3.2.3 阴性对照溶液的制备取缺金荞麦的阴性制剂，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

3.3 方法学考察

3.3.1 专属性试验精密吸取（-）-表儿茶素对照品溶液、原矢车菊素B2对照品溶液、金荞麦片供试品溶液、阴性对照溶液，按上述色谱条件分别进样，记录色谱图，结果显示阴性对照溶液对测定结果无干扰，见图2。

3.3.2 线性关系考察取质量浓度分别为11.36、22.72、45.44、68.16、90.88、136.32、181.76、227.20 μg/mL的（-）-表儿茶素对照品溶液，分别进样，记录色谱图，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=1.190 198×106X+1.475 990 × 103，r=0.999 968。（-）-表儿茶素在0.113 6～2.272 μg范围内与峰面积线性关系良好。

取质量浓度分别为 16.64、33.28、66.56、99.84、133.12、166.40 μg/mL 的原矢车菊素 B2对照品溶液，分别进样，记录色谱图，以进样量为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为Y=9.541 97×105X+5.989 5 ×104，r=0.999 702。原矢车菊素B2在0.166 4～1.664 μg范围内与峰面积线性关系良好。

图2 金荞麦片HPLC图

3.3.3 精密度试验取同一供试品溶液，重复进样5次，每次 10 μL，（-）-表儿茶素峰面积 RSD 为0.76%，原矢车菊素B2峰面积RSD为0.85%，表明仪器精密度良好。

3.3.4 稳定性试验取同一供试品溶液，于室温27 ℃的环境中放置，在 0、2、4、6、8、24 h，分别进样10 μL，记录色谱图，测得8 h内（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的RSD分别为0.66%和0.81%，24 h内（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2的RSD分别为1.5%和1.67%，试验结果表明供试品溶液在本实验条件下24 h内基本稳定。

3.3.5 重复性试验取同一批供试品6份，依法制备供试品溶液并测定，（-）-表儿茶素含量RSD为0.53%，原矢车菊素B2含量RSD为0.67%，结果表明方法重复性良好。

3.3.6 加样回收率试验取已知（-）-表儿茶素含量为646.06 μg/g金荞麦片样品6份，每份约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入0.623 mg/mL（-）-表儿茶素对照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，称定重量，摇散，照供试品溶液的制备项下自“超声处理……”起，依法制备供试品溶液，测定。（-）-表儿茶素平均加样回收率为97.12%，RSD为0.92%，见表1。

表1 （-）-表儿茶素加样回收率试验结果（n=6）

取已知原矢车菊素B2含量598.02 μg/g金荞麦片样品6份，每份约1.0 g，精密称定，置25 mL量瓶中，分别精密加入0.605 mg/mL原矢车菊素B2对照品溶液1 mL及乙腈-水（1∶9）25 mL，称定重量，摇散，照供试品溶液的制备项下自“超声处理……”起，依法制备供试品溶液，测定。原矢车菊素B2平均加样回收率为98.26%，RSD为0.61%，见表2。

表2 原矢车菊素B2加样回收率试验结果（n=6）

3.4 样品测定取金荞麦片5个批号样品，制备供试品溶液;取（-）-表儿茶素对照品、原矢车菊素B2对照品分别制备对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，结果见表3。

4 讨论

4.1 测定波长的选择在波长190～400 nm范围内，分别对（-）-表儿茶素对照品溶液、原矢车菊素B2对照品溶液进行光谱扫描，波长280 nm左右峰形均较好，最大吸收波长为280.0 nm。

4.2 对照品与含量测定成分的选择金荞麦有效成分为原花色素类缩合鞣质及其前体的混合物［2-4］，包括:（-）-表儿茶素［（-）-epicatechin］及其衍生物的单体、二聚体和多聚体，其中主要有效成分为原矢车菊素B2（procyanidin B2）。为了有效控制金荞麦片质量，鉴别、测定有效成分，在金荞麦片质量标准研究过程中使用（-）-表儿茶素、原矢车菊素B2对照品，证实TLC主斑点、HPLC主要色谱峰均为有效成分，但原矢车菊素B2对照品分离难度大、货源稀少，本实验中所用原矢车菊素B2对照品的含量偏低（95.6%）。在金荞麦片质量标准中，TLC鉴别使用金荞麦对照药材、HPLC测定（-）-表儿茶素含量即可。