β-榄香烯抑制人骨髓瘤细胞增殖

陈 浩， 师 亮， 王素云， 杨敬慈， 潘 崚*

（1.河北医科大学第二医院血液科，石家庄 050000;2.山西医科大学组胚教研室，太原 030001）

多发性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是骨髓内浆细胞异常增生的一种血液系统恶性肿瘤，目前尚缺乏有效治疗手段，故寻找新的治疗方法尤为必要［1］。β－榄香烯（β-elemene）是具有抗肿瘤功效的中药温莪术的有效提取物［2］。但对骨髓瘤影响如何，目前尚不清楚。本研究采用不同浓度β－榄香烯处理体外培养的人骨髓瘤RPMI－8226细胞，观察β－榄香烯对骨髓瘤细胞增殖、周期、凋亡等影响，以期为榄香烯用于对骨髓瘤的临床治疗提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞培养 人骨髓瘤RPMI－8226细胞由河北医科大学生物科技总公司提供。在含10%胎牛血清、青霉素100 U/mL、链霉素 120 μg/mL 的 RPMI－1640中37℃、5%CO2培养箱常规培养，生长曲线测试倍增时间为（24±1）h，1～2 d传代1次。所有实验均在细胞处于对数生长期时进行。

1.2 药品与试剂 β－榄香烯购自大连金港制药有限公司，使用前溶于磷酸盐缓冲液（PBS）中，配成1 000 μmol/L母液，超滤除菌，－20℃保存。碘化丙啶（PI）、噻唑蓝（MTT）购自 Sigma公司。Annexin V/PI双染试剂盒购于南京凯基生物公司。Hoechst33342/PI双染试剂盒购于河北渤海生物公司。

1.3 细胞增殖 采用MTT法检测。将处于对数生长期的RPMI－8226细胞（2×105/mL）接种于96孔板，每孔 200 μL。加入终浓度分别为 10、20、40、80 μmol/L的 β－榄香烯处理，对照组加入等体积的DMSO，每组各设4个平行孔;分别于药物作用后24、48 和72 h 时，每孔加入5 g/L MTT 20 μL，继续孵育4 h，离心去除上清后各加入DMSO 200 μL，轻微振荡使结晶溶解后，以酶标仪490 nm波长处测定各孔吸光度（A）值，计算增殖抑制率。

增殖抑制率=（1－实验组A值/对照组A值）×100%

1.4 流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡 按Annexin V－异硫氰酸荧光素（FITC）试剂盒操作流程，不同浓度β－榄香烯作用48 h后收集细胞，PBS充分洗涤，调整细胞密度为1×106/mL。取400 μL细胞悬液，加入5 μL 的 Annexin V－FITC，混匀，室温避光孵育10 min，离心去上清，重悬细胞后加入 PI使其终浓度为1 μg/mL，避光作用后上机检测细胞周期（FACScaliber，美国BD公司）。同法，另取细胞检测细胞凋亡。

1.5 Hoechst33342/PI双染荧光显微镜观察 不同浓度β－榄香烯作用48 h后收集细胞，PBS充分洗涤。1 000 r/min离心弃上清，1 mL培养液重悬，避光加入 10 μL Hoechst 33342，混匀，37℃ 孵育 8 min，PBS冲洗3次去除Hoechst33342，再加入终浓度为5 μg/mL PI染液，避光染色5 min，转移至载玻片，荧光显微镜下分别于350 nm及488 nm激发荧光，200倍镜下观察（正常细胞细胞核为暗蓝色;早期凋亡细胞细胞核呈亮蓝色;中期、晚期凋亡细胞细胞核呈淡红色或深红色;）。

2 结果

2.1 β－榄香烯对骨髓瘤RPMI－8226细胞体外生长的影响 β－榄香烯随着浓度增加和作用时间延长，对细胞增殖抑制作用增强，呈浓度、时间依赖性;（表1）。

表1 β-榄香烯对骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖的抑制作用（±s，n=4）Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line（RPMI-8226）

表1 β-榄香烯对骨髓瘤RPMI-8226细胞增殖的抑制作用（±s，n=4）Tab.1 Inhibitory effect of β-elemene on proliferation of human multiple myeloma cell line（RPMI-8226）

与0 μmol/L 组比较，P ＜0.01。

β－榄香烯/（μmol/L）24 h吸光度 抑制率/%48 h吸光度 抑制率/%72 h吸光度 抑制率/%0 0.216 7±0.024 1 0.531 5±0.010 4 0.822 2±0.0441.075 6±0.014 6 90.81 10 0.169 5±0.013 9 21.79 0.332±0.006 2 37.54 0.455 8±0.005 7 44.56 20 0.147 2±0.003 1 32.06 0.227±0.013 4 57.33 0.285 1±0.011 8 65.32 40 0.122 6±0.012 1 43.42 0.145 7±0.015 6 72.58 0.133 7±0.014 2 83.74 80 0.102 6±0.002 3 52.64 0.126 8±0.010 4 76.14 0

2.2 β－榄香烯对骨髓瘤RPMI－8226细胞周期的影响 数据显示:各药物处理组G0/G1细胞比例较对照组显著增加;G2/M、S期细胞比例较对照组减少（表2）。

2.3 β－榄香烯对骨髓瘤RPMI－8226细胞凋亡的影响 随β－榄香烯浓度的增加，药物组骨髓瘤细胞凋亡率递增（表3）。

表2 β-榄香烯作用48 h后对骨髓瘤RPMI-8226细胞周期的影响（±s，n=4）Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line（RPMI 8226）

表2 β-榄香烯作用48 h后对骨髓瘤RPMI-8226细胞周期的影响（±s，n=4）Tab.2 Influence of β-elemene on cell period of human multiple myeloma cell line（RPMI 8226）

与0 μmol/L组比较，*P ＜0.05，**P＜0.01。

β－榄香烯（μmol/L）各期细胞所占比例G0/G1 S G2/M 0 47.87±5.67 37.72±3.81 14.41±2.26 10 54.68±4.03** 33.96±2.04* 11.36±1.79*20 60.11±5.78** 30.15±2.42* 8.63±1.05**40 65.26±6.36** 27.84±1.89** 4.94±1.32**80 71.33±5.81** 25.21±2.01** 2.46±0.98**

表3 β-榄香烯作用48 h后对骨髓瘤RPMI-8226细胞凋亡的影响（¯x ± s，n=4）Tab.3 Infuence of β-elemene on apoptosis rate of human multiple myolema cell line（RPMI-8226）in 48 h

2.4 Hoechst33342/PI双染荧光显微镜观察 对照组镜下可见大量暗蓝色正常骨髓瘤RPMI－8226细胞，偶见凋亡细胞。10、20 μmol/L β－榄香烯处理组镜下可见典型凋亡细胞，以早期凋亡细胞为主，细胞核呈亮蓝色，染色质凝集，或核呈分叶、碎片状边集。40、80 μmol/L β－榄香烯处理组镜下可见大量凋亡细胞，中期、晚期凋亡细胞增多，细胞核呈淡红色或深红色，染色质片段化凝集呈多个亮点;还可见少量体积增大、核溶解、深红色或亮红色的细胞。

3 讨论

β－榄香烯是抗肿瘤中药温莪术的有效提取物［2］。鉴于此，本研究首先通过 MTT实验观察β－榄香烯对骨髓瘤细胞体外生长的影响，结果发现不同浓度β－榄香烯对骨髓瘤细胞增殖均有抑制作用，且呈浓度和时间依赖性。提示β－榄香烯可抑制骨髓瘤细胞增殖。

本研究结果还表明β－榄香烯可阻滞骨髓瘤细胞生长周期，激活细胞凋亡通路，还可能启动细胞“凋亡”机制［3］，导致体外培养的骨髓瘤细胞增殖抑制，有望成为新的骨髓瘤临床治疗药物。

［1］Dmoszynska A.Diagnosis and the current trends in multiple myeloma therapy［J］.Pol Arch Med Wewn，2008，118:563－6.

［2］Peng X，Zhao Y，Liang X，et al.Assessing the quality of RCTs on the effect of beta－elemene，one ingredient of a Chinese herb，against malignant tumors［J］.Contemp Clin Trials，2006，27:70－82.

［3］Van Cruchten S，Van Den Broeck W.Morphological and biochemical aspects of apoptosis，oncosis and necrosis［J］.Anat Histol Embryol，2002，31:214－23.