p38MAPK在IL-18诱导肾小管上皮细胞转分化中的作用*

张军峰，姚翠微，刘华锋，梁 东，陈孝文

(广东医学院附属医院肾病研究所，湛江 524001)

肾间质纤维化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各种慢性肾脏疾病进展至终末期肾病的共同途径，涉及到多方面的机制[1]。肾小管上皮细胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)向肌成纤维细胞(myofibroblast，MyoF)转分化(tubular epithelial-myofibroblast transdifferentiation，TEMT)是肾间质纤维化的重要机制之一[2]。肾小管上皮细胞发生转分化后，转变成为肌成纤维细胞，表达α-平滑肌肌动蛋白(αsmooth muscle actin，α-SMA)，将其分泌到细胞外基质(extracellular matrix，ECM)，促进肾间质纤维化的发生。白细胞介素18(IL-18)是一重要的促炎因子，我们前期研究表明:多种慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)均有IL-18的表达和分泌异常，并且肾组织IL-18的表达量与肾小管-间质的损害程度呈正相关[3-4]，我们还进一步在体外实验中证实IL-18可促进RTECs转分化和凋亡[5]。但IL-18参与肾小管上皮细胞转分化的细胞内信号通路尚未明确。p38MAPK是重要的细胞内信号转导通路，本课题旨在探讨IL-18是否通过该细胞通路介导肾小管上皮细胞转分化。

1 材料与方法

1.1 细胞培养

HK-2细胞株为人近曲肾小管上皮细胞株(上海交通大学附属瑞金医院陈楠教授馈赠)。细胞在含10%FBS 、0.03%L-Glutamine、100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素的DMEM/F12培养基中传代培养，培养条件为37℃、5%CO2。实验开始时，细胞按 1×105cells/ml的密度均匀接种至六孔板。培养24h至亚融合状态时用无血清DMEM/F12培养基同步细胞 24h ，加入含不同浓度(0μmol/L 、5μmol/L 、10μmol/L 、20μmol/L)的 SB203580(Calbiochem ，德国)预孵育30min，除空白对照组外，其余各组再加入终浓度为100ng/ml的人重组IL-18(MBL，日本)，继续培养24h、48 h、72 h，按期收集细胞，实验重复3次。

1.2 ELISA方法检测培养HK-2细胞上清α-SMA水平

PBS 洗涤细胞，吸干PBS，每孔加入120μl细胞裂解液(含0.1 mg/ml PMSF和0.1%aprotinin)，充分混匀后置4℃裂解过夜，次晨4℃、12000r/min离心10min获取上清液，-70℃保存备用。采用细胞酶联免疫吸附法(ELISA)检测细胞裂解后上清α-SMA蛋白质水平，人α-SMA ELISA试剂盒购自BPB(U.S.A)，灵敏度为0.1 ng/ml，检测过程严格按试剂盒说明书操作，所有的标准品和待测样品做双孔，α-SMA水平以pg/mg蛋白表示。

1.3 RT-PCR方法检测HK-2细胞α-SMA mRNA表达

收集细胞后，PBS洗涤细胞，用TRIzol(Invitrogen，U.S.A)抽提细胞总RNA，继之应用逆转录试剂盒(Invitrogen，U.S.A)进行 cDNA第一链的合成;PCR扩增条件、引物及产物见表1。PCR产物在2%琼脂糖凝胶电泳中分离，凝胶成像系统成像，图象分析处理系统进行灰度扫描、拍照、分析电泳带积分光密度。

Tab.1 Primer array and condition of PCR amplification

1.4 统计方法

2 结果

2.1 SB203580对HK-2细胞α-SMA mRNA表达的影响

IL-18可显著提高HK-2细胞α-SMA mRNA的表达，SB203580对IL-18诱导的α-SMA mRNA表达具有显著的抑制作用，并呈一定的剂量依赖趋势(图1，表2)。

Fig.1 Effect of SB203580onα-SMA mRNA expression of HK-2 cells

Tab.2 Effect of SB203580on α-SMA mRNA expression of HK-2 cells(，n=3)

Tab.2 Effect of SB203580on α-SMA mRNA expression of HK-2 cells(，n=3)

*P＜0.01 vs control;#P＜0.05，##P＜0.01 vs IL-18

Group α-SMA mRNA/β-actin mRNA 24h 48 h 72 h Control 0.189±0.019 0.209±0.021 0.308±0.018 IL-18 group 0.436±0.045* 0.633±0.052* 0.716±0.039*IL-18+5 ng/ml SB203580 0.336±0.036# 0.522±0.035# 0.678±0.081 IL-18+10ng/ml SB203580 0.263±0.026## 0.501±0.029## 0.595±0.034 IL-18+20ng/ml SB203580 0.236±0.036## 0.420±0.024## 0.560±0.056#

2.2 SB203580对HK-2细胞α-SMA表达的影响

IL-18可显著提高HK-2细胞表达α-SMA蛋白质，SB203580对IL-18诱导的α-SMA蛋白质表达具有显著的抑制作用，并呈一定的剂量依赖趋势(表3)。

Tab.3 Effect of SB203580on α-SMA protein expression of HK-2 cells(，n=3)

Tab.3 Effect of SB203580on α-SMA protein expression of HK-2 cells(，n=3)

**P＜0.01 vs control;##P＜0.01 vs IL-183

Group α-SMA/total protein(pg/mg)24h 48 h 72 h Control 0.926±0.022 0.949±0.012 0.979±0.014 IL-18 group 1.500±0.018** 1.658±0.031** 1.779±0.023**IL-18+5 ng/ml SB203580 1.354±0.024## 1.610±0.022 1.757±0.016 IL-18+10ng/ml SB203580 1.265±0.016## 1.553±0.014## 1.721±0.020##IL-18+20ng/ml SB203580 1.218±0.025## 1.480±0.026## 1.683±0.018##

3 讨论

IL-18是一种主要由单核/巨噬细胞分泌的炎症因子。我们与国内外同行的研究均已证实IL-18参与急、慢性肾损伤过程[3-4，6-7]。IL-18参与肾损害的机制之一是促进RTECs转分化和凋亡，从而参与CKD的肾小管-间质纤维化发生发展过程。近年来，关于上皮细胞转分化的细胞内信号转导机制研究受到国内外学者的广泛关注，王玉等[8]发现IL-1β刺激肾小球系膜细胞表达α-SMA表达由p38MAPK途径介导;张梅等[9]报道抑制p38MAPK通路可下调血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)所诱导的肾小管上皮细胞α-SMA的表达。Zhang等[10]研究发现IL-1β可通过激活c-Jun氨基端激酶(C-Jun N-terminal kinase，JNK)和p38MAPK信号途径介导HK-2细胞转分化。IL-18是否通过p38MAPK通路介导RTECs转分化，目前国内外尚未见资料报道。

为此我们首先观察了IL-18对HK-2细胞α-SMA表达的影响，结果表明IL-18呈时间依赖性地明显上调α-SMA的表达，细胞形态也由正常的铺路石样变为梭形，表明部分HK-2细胞转分化为MyoF，此结果进一步证实了IL-18可促进肾小管上皮细胞表型转化[5]。接着我们应用 p38MAPK特异性阻断剂SB203580阻断p38MAPK的活性，观察其对IL-18上调HK-2细胞表达α-SMA的影响。结果发现，予SB203580预孵育HK-2细胞后，IL-18所诱导HK-2细胞α-SMA的基因转录和蛋白合成均受抑制，其抑制作用与抑制剂SB203580的浓度呈一定程度剂量依赖关系。Zhang[10]等发现p38MAPK信号通路也是介导IL-1β所诱导HK-2细胞转分化的通路，即IL-18和IL-1促RTECs转分化可能通过相同通路，因此，抑制p38MAPK信号通路可能同时阻断IL-18和IL-1两种有害炎症因子的作用，p38MAPK通路能否作为减轻CKD患者肾小管-间质损伤治疗的新靶点值得进一步研究。

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