黑木耳多糖对抗离体心脏缺血/再灌注损伤的研究*

2010-05-24叶挺梅钱令波王会平叶治国

中国应用生理学杂志 2010年2期

叶挺梅，钱令波，崔洁，王会平，叶治国，夏强△

(1.丽水学院化学与生命科学院生物系，浙江丽水 323000;2.浙江大学医学院生理学教研室，杭州 310058)

心肌梗死是当今人类的主要致死原因之一，血栓阻塞冠状动脉导致不可逆的心肌细胞损伤，时间依赖性的由心内膜扩展到外膜，必须进行急性心梗的再灌注治疗。最有效的治疗心肌梗死的方法是尽快疏通闭塞的血管，恢复血供，从而阻止细胞坏死的扩展。早期再灌注是缺血心肌存活的必要前提。然而，再灌注本身可引起细胞损伤进一步加重，即再灌注损伤，再灌注损伤的临床表征包括心肌坏死、心律失常、心肌顿抑、内皮和微血管功能失调甚至无复流现象[1]。尽管已有大量的动物实验报道药物预处理、后处理，缺血预处理、后处理，远距预处理等均能减少心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)损伤[2，3]，但是因为心肌I/R损伤的病理机制极其复杂，主要涉及再灌注早期的氧自由基爆发、中性粒细胞介导的炎性损伤、细胞内Ca2+超载等[3]。迄今为止，尚没有有效的措施来减少临床上心肌I/R损伤。黑木耳(auricularia auricula)是我国珍贵的药用和食用胶质真菌。黑木耳多糖(auricularia auricular polysaccharides，AAP)为其重要活性成分，具有降血糖、抗脂质过氧化及清除氧自由基等多种生物活性，已在多种动物模型上得到证实[4，5]。但是有关黑木耳多糖的心血管作用却罕见报道。因此，本实验应用Langendorff灌流模型研究AAP对离体大鼠心脏I/R时心功能指标、脂质过氧化程度及自由基清除能力的影响，为黑木耳的保健和治疗I/R损伤等疾病提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂

Tris-HCl，EDTA-2Na，氯化三苯四氮唑(2，3，5-triphenyl-tetrazolium chloride，TTC)购自 Sigma公司。LDH、MDA和SOD检测试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。复方丹参液，江苏省东台市制药厂生产，每毫升相当于1.5 g生药，批号20070830。AAP:黑木耳干粉按1∶90(w/v)加水浸泡30min，加入纤维素酶和果胶酶酶解，加热至90℃使酶灭活，热水浸提、离心、减压浓缩后，用 95%乙醇沉淀多糖，静置过夜、洗涤，将多糖沉淀复溶，加入氯仿与正丁醇、Sevage试剂反复脱蛋白、离心，减压浓缩、真空冷冻干燥后得到黑木耳多糖粉末。其余试剂为市售分析纯。改良Krebs-Henseleit(K-H)液(mmol/L):NaCl 118 ，KCl 4.7 ，KH2PO41.2 ，MgSO41.2 ，NaHCO325 ，glucose 10，CaCl22.5。

1.2 离体心脏Langendorff灌流和左室功能评价

雄性SD大鼠(体重230～260g，由浙江大学实验动物中心供应)，4%水合氯醛10ml/kg体重进行麻醉，断头后开胸迅速取出心脏，置于4℃改良K-H液中洗净血液，迅速转移、固定于Langendorff灌流装置，以改良K-H液行常规恒压(10.1 kPa)灌流，维持灌流液温度35℃。切开左心耳，将充水乳胶囊由此插入至左心室，囊内压力经特氟纶管传递至压力传感器，由PowLab生物信号采集处理系统记录和分析。向插入左心室内的乳胶囊注水使左心室舒张末压(1eft ventricular end diastolic pressure，LVEDP)维持于0.53～1.07 kPa，连续记录实验过程中左心室发展压(1eft ventricular developed pressure，LVDP)、心率(heart rate，HR)、心率与发展压的乘积(rate pressure product，RPP)、左心室内压最大上升和下降速率(maximal rise/fall rate of left ventricular pressure，±dP/dtmax)等各项指标。

1.3 I/R处理方法

采用全心停灌的处理方法，平衡20min后，以停止灌流30min，复灌120min作为I/R过程。

1.4 冠脉流量的测定

在平衡末1 min及复灌30，60，90，120min的最末1 min收集冠脉流出液，测量其体积作为相应时间点的冠脉流量(coronary flow，CF)。

1.5 冠脉流出液乳酸脱氢酶活性的测定

在复灌各时间点收集冠脉流出液，按照试剂盒要求，用分光光度法测定乳酸脱氢酶(1actate dehydrogenase，LDH)的含量。原理为LDH催化丙酮酸盐还原生成乳酸，同时NADH被氧化成NAD+，引起340nm吸光度的下降，其下降速率与样本中LDH活力成正比，通过吸光度变化率计算LDH活性。

1.6 心肌细胞活性的测定

TTC与活细胞反应生产甲月赞(formazan)，该物质是反映心肌活性的指标之一。心脏从灌流装置上取下后切成薄片(1～2 mm)，在37℃水浴中用1%TTC孵育30min。取出心肌片吸干表面的水分并称其湿重，按20ml/g的量加入二甲基亚砜后匀浆，匀浆液离心(2623 r/min，10min)，取上清液1 ml在 490nm处测量其吸光度以反映心肌formazan水平。

1.7 心肌组织MDA和SOD水平测定

实验结束时取下心脏，迅速减去左右心房及房室隔，称重，再迅速转移到预冷的匀浆液中(10mmol/L Tris-HCl，0.1 mmol/L EDTA-2Na，10mmol/L sucrose ，0.8%NaCl，pH 7.4)剪碎，用内切式组织匀浆器制成10%的组织匀浆(匀浆时间每次10s，间歇30s连续3次，在冰水中进行)。取10%的组织匀浆5～ 10ml，以 3000r/min，4℃离心 10min，取上清液用以测定酶活力。以硫代巴比妥酸法测定丙二醛(malondialdehyde，MDA)，以黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)，蛋白质含量用考马斯亮蓝法定量。

1.8 实验分组

大鼠随机分为6组(n=10):(1)AAP高剂量组(HAAP):正常大鼠灌胃 AAP(200mg/(kg◦d))共 4周，再行离体心脏全心 I/R;(2)AAP中剂量组(MAAP):正常大鼠灌胃AAP(100mg/(kg◦d))共 4周，再行离体心脏全心I/R;(3)AAP低剂量组(LAAP):正常大鼠灌胃AAP(50mg/(kg◦d))共4周，再行离体心脏全心I/R;(4)正常对照组(Con):正常大鼠灌胃同等体积的生理盐水共4周，再行离体心脏Langendorff灌流170min;(5)模型对照组(I/R):正常大鼠灌胃同等体积的生理盐水共4周，再行离体心脏全心I/R;(6)复方丹参阳性对照组(Compound Radix Salviae Miltiorrhizae，CRSM):正常大鼠灌胃丹参(4 ml/(kg◦d))共4周，再行离体心脏全心I/R。

1.9 统计学处理

2 结果

2.1 AAP预处理对I/R心脏左心室收缩功能及冠脉流量的影响

与模型对照组(I/R)相比，低、高剂量AAP(50，200mg/(kg◦d))预处理4周后均明显减弱I/R对LVDP、+dP/dtmax、RPP的抑制作用，AAP改善心功能的作用要强于CRSM(表1，表2)。与I/R组相比，HAAP组显著抑制了I/R导致的CF减少，LAAP组与CRSM组对CF作用不明显(表3)。

Tab.1 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on RPP and LVDP in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

RPP:LVDP×HR;LVDP:Left ventricular development pressureI/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120RPP(%of baseline(kPa×b/min))I/R 100(3661.24±562.28) 63.60±9.30 51.51±8.80 43.43±8.72 40.08±6.35 LAAP 100(3418.97±550.08) 72.44±14.04 65.52±11.81** 58.21±9.23** 53.21±9.07**HAAP 100(3910.12±643.75) 82.31±6.13** 72.70±7.63** 69.39±5.60** 68.24±4.48**CRSM 100(3426.16±436.21) 74.22±7.29 68.73±7.04** 58.94±9.45** 48.68±6.88*LVDP(%of baseline(kPa))I/R 100(12.72±1.09) 78.31±11.17 64.51±9.31 56.65±9.42 51.22±8.88 LAAP 100(12.15±1.56) 87.83±12.25 78.98±10.11** 69.61±10.58* 62.47±9.21*HAAP 100(12.15±0.83) 92.28±9.59* 85.92±9.05** 80.33±9.22** 75.65±8.77**CRSM 100(11.90±1.35) 89.10±10.90 77.89±10.90** 68.18±9.59* 59.53±10.30

Tab.2 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on±dP/dtmax in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

±dP/dtmax:Maximal rise/fall rate of left ventricular pressureI/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120+dP/dtmax(%of baseline(kPa/s))I/R 100(561.75±94.99) 80.20±10.38 78.98±12.51 69.51±11.11 71.11±11.81 LAAP 100(548.30±86.44) 89.23±11.56 82.52±11.12 76.36±10.25 70.12±9.49 HAAP 100(656.42±82.55) 103.61±10.92** 99.22±9.77** 91.88±9.14** 94.36±10.81**CRSM 100(649.48±55.96) 90.51±10.13 83.91±11.17 76.86±10.41 72.12±11.21-dP/dtmax(%of baseline(kPa/s))I/R 100(-405.1±41.8) 76.53±9.98 73.66±10.99 63.86±11.11 57.38±11.18 LAAP 100(-550.1±56.4) 77.58±9.53 75.37±10.17 68.21±9.02 60.41±9.12 HAAP 100(-628.2±70.5) 89.89±10.71* 79.82±9.89 69.91±9.79 60.21±10.49 CRSM 100(-439.5±56.9) 70.86±10.61 62.49±9.91 58.29±8.91 55.74±7.83

Tab.3 Effect of 4 week treatmentwith auricularia auricular polysaccharides(AAP)on coronary flow in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

I/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group*P＜0.05，**P＜0.01 vs I/R group

Variable Baseline Reperfusion(min)30 60 90 120I/R 100(7.8±0.4) 65.23±8.20 58.21±6.44 48.61±6.71 41.12±8.35 LAAP 100(7.25±0.78) 69.97±9.39 64.29±9.03 55.61±8.16 45.99±7.47 HAAP 100(8.03±0.48) 87.41±9.38** 80.91±9.65** 75.23±8.41** 68.98±8.88**CRSM 100(8.46±0.66) 73.18±9.75 68.66±9.57* 58.54±8.83* 53.23±7.70**

2.2 AAP预处理对I/R心肌梗死状况及其LDH含量的影响

与模型对照组(I/R)相比，低、中、高剂量AAP(50，100，200mg/(kg◦d))预处理4周后，心肌细胞活性明显改善，表现为formazan含量明显升高(P＜0.01)，呈剂量依赖性;高剂量AAP升高formazan含量的作用要强于CRSM，与空白对照组相比无显著性差异(图 1)。与 I/R组比较，低、中、高剂量AAP处理组复灌5 min、10min冠脉流出液中LDH含量显著下降(P＜0.01)，且具有剂量依赖性;高剂量AAP抑制 I/R心肌LDH释放的作用要强于CRSM(图2)。

Fig.1 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)onformazan content in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)Con:Blank control group;I/R:Ischemia/reperfusion group;LAAP:Low dose of AAP(50mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;MAAP:Middle dose of AAP(100mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;HAAP:High dose of AAP(200mg/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group;CRSM:Compound radix salviae miltiorrhizae(4 ml/(kg◦d))+ischemia/reperfusion group

2.3 AAP预处理对I/R心肌组织MDA和SOD水平的影响

与模型对照组(I/R)相比，AAP(100mg/(kg◦d))预处理4周后明显抑制I/R心肌MDA水平增加及SOD活性下降(P＜0.01)，AAP组MDA与SOD与空白对照(Con)相比无显著性差异;AAP抑制I/R心肌MDA增加及SOD下降的作用要强于CRSM(图3见下页)。

Fig.2 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)on lactate dehydrogenase(LDH)in the coronary effluent of the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

3 讨论

本实验首次在离体灌流的大鼠心脏I/R模型上发现AAP预处理4周可减少I/R后心肌细胞死亡，增加冠脉流量，减少心肌标志酶LDH的漏出，改善灌注后左心室收缩功能，并且呈剂量依赖性，这些作用可能与其增加SOD活性，减轻I/R脂质过氧化和氧化应激损伤有关。

Fig.3 Effect of 4 week treatment with auricularia auricular polysaccharides(AAP)on malondialdehyde(MDA)level(A)and superoxide dismutase(SOD)activity in the isolated rat heart subjected to ischemia/reperfusion(，n=10)

已证实，心肌I/R将引起心功能下降、心律失常、心肌酶漏出以及线粒体受损等，其机制可能主要涉及心肌I/R时产生的氧自由基损伤[1]。有研究表明，黑木耳多糖、木耳多糖可明显抑制MDA生成及线粒体肿胀，并能明显清除超氧阴离子，且呈剂量效应关系[6]。黑木耳所含的多糖类物质是酸性异葡聚糖，主要成分为木糖、葡萄糖醛酸、甘露糖及少量的葡萄糖和岩藻糖，有一定的抗炎症、抗氧化作用[7]。本实验结果显示，经黑木耳多糖预处理的I/R组心肌SOD水平明显高于模型对照(I/R)组，MDA含量较I/R组有显著的降低，表明黑木耳多糖能显著增强心肌的抗氧化能力，增强心肌对I/R损伤的耐受程度。本实验结果也表明黑木耳多糖发挥抗氧化作用的主要机制是抑制MDA的过量生成和促进SOD的活性，这可能与其高含量的酸性异葡聚糖有关。本实验还发现黑木耳多糖的抗心肌I/R损伤的作用要强于冠心病治疗药物丹参，这有可能与黑木耳多糖极强的抗氧化性能有关，也预示着黑木耳多糖极有可能发展成为一种更高效的抗心肌I/R损伤药物。

国内外关于黑木耳多糖对心血管的保护作用研究较少，本实验也仅仅局限于黑木耳多糖对I/R心肌的抗氧化作用研究。由于心肌I/R损伤机制复杂，牵涉到细胞内钙超载，中性粒细胞炎性反应，线粒体功能紊乱等一系列病理变化[3]，单从抗氧化角度是不足以有效防治心肌I/R损伤的。黑木耳多糖含有丰富的羟基基团，而且不同化学结构和不同构象的黑木耳多糖组分表现出不同的生理活性，黑木耳多糖能否通过对抗自由基的作用，从而减轻I/R对心肌细胞内钙库，以及线粒体功能的影响尚需进一步研究。

综上所述，黑木耳多糖具有抗心肌I/R损伤的保护作用，其机制可能与其增加心肌SOD活性，减少脂质过氧化损伤有关。进一步深入研究黑木耳多糖对抗心肌I/R损伤的靶点以及相关的信号通路将具有非常重要的临床前意义。

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