特发性矮小患儿 Shox基因突变及多态性分析

谢蓉蓉,陈临琪,李桂梅

(1苏州大学附属儿童医院,江苏苏州 215003；2山东大学附属省立医院)

人体身高由多基因决定,研究显示,儿童身材矮小发生率约 3%,大多数原因未明[1],在促进身高生长中起关键作用的矮小同源盒(Shox)基因异常与Leri-Weill软骨骨生成障碍(LWD)、Turner综合征及(TS)、特发性矮小(ISS)等有关。为了解 Shox基因突变在山东地区矮小儿童中的发生情况,2006年 10月 ～2007年 3月,我们对 25例 ISS患儿进行了 Shox基因突变及多态性研究。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选择在山东大学附属省立医院就诊的 ISS患儿 25例,男 18例、女 7例,年龄 5～15岁。患儿身高低于同种族、同性别正常人群均值-2s或低于第三百分位数。排除生长激素缺乏症、甲状腺功能低下、营养不良、垂体肿瘤、TS所致的矮小,其生长激素正常或增高,胰岛素样生长因子 1和胰岛素样生长因子结合蛋白 3正常或低下,骨龄落后；均有以下 1项或 1项以上骨骼异常:前臂中部和小腿短小、短掌骨、曲腕畸形、提携角增大、肘外翻。

1.2 检测方法

1.2.1 DNA提取和 PCR扩增 取受检者外周抗凝血 3 ml,采用酚—氯仿抽提方法提取外周血基因组DNA,离心后取上清液,-80℃保存备用。采用常规 PCR扩增,PCR反应总体积 49μl,其中含 Taq DNA聚合酶 1.0μl、10×反应缓冲液,进行 32个循环。PCR产物用 1.5%琼脂糖凝胶检测,每个样品进行 32次 PCR反应,分别扩增 Shox基因外显子,引物设计参考文献[2,3],引物序列见表1。

1.2.2 DNA序列分析 采用 PCR产物直接测序方法、北京博亚公司产 ABI377全自动序列分析仪分析样品纯化及序列。对正向测序异常标本进行反向测序,予以确证,测序结果与 GENEBANK进行比较。

表1 Shox基因的引物序列

2 结果

本组 ISS患儿未发现 Shox基因突变。经 DNA直接测序,发现 1例患儿 Shox基因序列改变,碱基7 448 T＞G(rs 2239402),位于内含子区域,与 Haga等[4]报道的 Shox基因多态性结果相符。

3 讨论

Shox基因克隆定位于 X和 Y染色体短臂末端(Xp22.32或 Yp11.3)伪常染色体区域(PAR1),全长 40 kb；其中完全编码序列 879 bp,由 7个外显子组成,大小 58～1 166 bp,为成对相关的同源盒基因家族成员,其在种属间具有高度保守性。Shox基因在人骨源性组织中高度表达,自胚胎第 8周开始Shox mRNA在原始骨表达,胚胎 12周起 Shox蛋白在生长板的储备区、增生区和肥大区(主要是肥大/凋亡的软骨细胞上)广泛表达。有学者推测,双拷贝 Shox基因表达可能具有潜在抑制雌激素对肢骨中远端的负性生长作用(抑制骨骼生长,促进骨骼成熟),提示 Shox基因功能似乎与骨骼线性生长的启动子和骨骺融合的抑制子有关[5]。Shox基因逃避 X染色体失活,其基因突变或缺陷致相关蛋白表达量不足可导致软骨细胞增殖、分化紊乱,失去生长板增殖层和终末期细胞凋亡间的平衡；丧失抑制雌激素对生长板的负性生长作用,从而影响最终身高；患儿可伴有肢中部短小、掌骨短、屈腕畸形、提携角增大等肢骨畸形,这些骨畸形可见于 TS、LWD和Langer综合征、ISS。据报道[6],用荧光原位杂交技术和直接测序法检测 ISS患儿的 Shox基因,发现其突变发生率为 2.0%～12.5%。

Schneider等[7]发现,在 ISS和 LWD患者中,Shox基因突变通过引发 DNA结合丢失、二聚化能力降低和核转运能力损伤导致其生物功能改变。此外,点突变(c458 G＞T,p R153L)尽管不影响 Shox基因 DNA结合、二聚化能力和核转录,但能影响其转录激活能力,改变生物功能。因此认为,错义突变能损害 Shox基因关键功能,导致身材矮小表型[8]。

本研究检测到 1例 ISS患儿 Shox基因序列改变,其改变与 Haga等[4]报道的 Shox基因多态性结果相符。单核苷酸多态性是指由单个核苷酸替代、插入或缺失形成的分子多态,其中最少的一种在人群中的出现频率不小于 1%。由此推测,Shox基因突变可能不是山东地区 ISS患儿的突变特点,也可能与样本量小、种族或未检测 Shox外显子 1有关,有待进一步研究。

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