内异康复片对子宫内膜异位症异位和在位内膜血管形成相关因子的实验研究

魏绍斌 王妍 李白雪

子宫内膜异位症(endometriosis, EMT)是妇科疑难病症，主要表现为盆腔疼痛、痛经、不孕、月经异常等，严重影响女性的身体健康和生活质量。尽管其发病机理复杂，但越来越多的研究表明，血管形成在EMT的发生发展中起着重要的作用[1]。血管形成取决于血管形成刺激因子和抑制因子之间，以及效应细胞(主要是血管内皮细胞)与细胞外基质之间的相互平衡。血管形成相关因子通过直接、间接或各因子之间的相互作用，促进了EMT发生、发展。成都中医药大学附属医院妇科魏绍斌等以湿热瘀结立论，拟定了“清湿化瘀、行气止痛、消癥散结”治法，研制出院内制剂内异康复片，通过实验研究检测EMT大鼠异位和在位内膜血管内皮生长因子(VEGF)、内皮抑制素(ENS)、血管内皮生长因子/内皮抑制素(V/E)、微血管密度(MVD)及微血管数目的表达，探讨内异康复片对EMT模型大鼠异位和在位内膜的不同影响及其作用环节和靶点，初步阐明其治疗EMT抗血管生成的作用机理。

1 材料与方法

1.1 实验动物

健康性成熟未交配过的雌性SD大鼠，60只，体重180～250 g，一级动物，检疫合格，由成都中医药大学实验动物中心提供，批号：SCXK(川2008-11)，合格证号：川实动管质第6351号。

1.2 实验药物

内异康复片浸膏：按成人每日用量3 g/kg体重计算，每毫升浸膏制剂含3 g生药。由成都中医药大学附属医院制剂科制备。丹莪妇康煎膏(中药阳性对照药物)：成人每日用量0.5 g/kg体重，由昆明滇虹药业有限公司出品，国药准字：Z20025253，产品批号：080601。丹那唑胶囊(西药阳性对照药物)：按成人每日用量600 mg/60 kg体重计算，由上海华联制药有限公司出品，国药准字：H31021681，产品批号：080305。

1.3 实验试剂

一抗：VEGF(BA0407)Rabbbit polyclonal IgG，200 μg/ml；ENS (BA1609) Rabbit polyclonal IgG，200 μg/ml；CD31 (BA2211) Rabbit polyclonal IgG，200 μg/ml。均购自湖北武汉博士德生物技术有限公司。

二抗：(生物素标记的羊抗兔血清)及相应的试剂盒均购自北京市中杉生物技术有限公司。

1.4 实验仪器

光学显微镜，型号：BH-2；数码摄像机，型号：TK-C1381EG；BIOMIAS图像分析系统；切片机，型号：AO.802；切片漂烘控温仪，型号：QO-B；脱水机，型号：TS-12G；包埋机，型号：BMJ-3；病理组织包埋冷冻台。

1.5 分组及给药

采用自体移植法[2]建立EMT大鼠模型，30天后随机抽取动物剖腹证实模型成功，随机分为内异康复片浸膏高[6.0 g/(100 g·d)]、中剂量组[(3.0 g/(100 g·d)]、丹那唑组[0.1 g/(kg·d)]、丹莪妇康煎膏组[5.0 g/(kg·d)]、模型组和空白组。内异康复片浸膏高、中剂量组、丹莪妇康煎膏组和丹那唑组灌胃给药，其余灌胃与内异康复片高剂量组等容积的生理盐水。以上各组每天给药一次，连续30天。

1.6 标本的采集与处理

于末次给药后24小时，颈椎脱臼处死大鼠，立即剖腹取出异位种植内膜组织(根据造模后抽样检测结果，取子宫中段系膜处的异位种植内膜组织)和左子宫(非手术侧)，置于10%中性甲醛溶液中固定保存。

1.7 异位和在位内膜VEGF和ENS的染色及检测

将剖腹取出的异位种植内膜组织和左子宫(非手术侧)置于10%中性甲醛液中固定，48小时后取出，经常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片(片厚4 μm)、采用免疫组化SP法染色。采用Mias图形分析系统，在400倍视野下选择异位和在位内膜组织的被覆上皮中含阳性物质(即棕黄色颗粒物质)最多的5个区域浏览，测量阳性物质的积分光密度，以此表示VEGF、ENS的表达情况。

1.8 异位和在位内膜MVD的检测方法

通过标记CD31，计数着色的毛细血管和微小血管，凡呈现棕色单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为1个血管记，采用Mias图形分析系统，在100倍视野下扫视整张切片，确定微血管最密集的5个视野(新生血管热点区)，然后在400倍视野范围内计数所有染色的微血管，取5个视野计数结果的均数为该切片的微血管数。

1.9 统计学分析

所有数据均由SPSS 12.0统计软件进行处理，定量指标用单因素方差分析，组间比较用最小显著差数法(least significant difference，LSD)分析，Student-Newman-Keuls(SNK)检验和基于t检验的保守成对比较(Tamhane’s T2)检验。

2 实验结果

VEGF、ENS在各组异位和在位内膜中主要表达于被覆上皮细胞的胞浆和部分基质血管内皮细胞的胞浆，部分间质细胞有弱着色，表现为均质、棕黄色的颗粒状或细丝状。子宫内膜间质、子宫平滑肌细胞，血管平滑肌细胞也呈阳性表达。

2.1 对异位和在位内膜VEGF、ENS表达的影响

异位内膜VEGF的表达：光镜下见模型组异位内膜中VEGF阳性物质呈深棕色分布；各用药组呈浅棕色分布。半定量检测结果示：内异康复片高、中剂量组能明显降低大鼠异位内膜VEGF的表达(P<0.01)。见表1。

在位内膜VEGF的表达：光镜下空白组和模型组在位内膜中VEGF阳性物质呈棕黄色分布，分布较密集；各用药组与空白组和模型组比较，其深度有减弱的趋势。半定量检测结果示：内异康复片高、中剂量组、丹莪妇康煎膏组VEGF的表达与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。丹那唑组与其余各组比较差异具有显著性(P<0.05)。见表1。

异位内膜ENS的表达：光镜下见模型组异位内膜中ENS阳性物质呈浅棕色分布；各用药组与模型组比较，其深度有不同程度的增加，呈深棕色表达分布。半定量检测结果示：内异康复片高、中剂量组较模型组大鼠异位内膜ENS的积分光密度值差异具有极显著性(P<0.01)。见表1。

在位内膜ENS的表达：光镜下空白组和模型组在位内膜中ENS阳性物质呈棕黄色分布；各用药组与空白组和模型组比较，其深度有增强的趋势。半定量检测结果示：内异康复片高剂量组、丹莪妇康煎膏组在位内膜ENS的积分光密度数值与空白组和模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)。内异康复片中剂量组、丹那唑组与空白组和模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

2.2 对异位内膜和在位内膜V/E比值的影响

内异康复片高、中剂量组、丹那唑组、丹莪妇康煎膏组异位内膜V/E值较模型组均有显著性降低，差异有统计学意义(P<0.05)。各用药组之间差异无统计学意义(P>0.05)。模型组、内异康复片高、中剂量组、丹那唑组、丹莪妇康煎膏组在位内膜V/E值，与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

2.3 对异位和在位内膜MVD表达的影响

异位内膜MVD的表达：光镜下见模型组异位内膜中MVD阳性物质呈深棕色表达分布；各用药组与模型组比较，其深度有不同程度得降低，且密度程度明显降低。半定量检测结果示：内异康复片高剂量组、丹那唑组均明显降低大鼠异位内膜MVD的表达，与模型组比较差异具有极显著性(P<0.01)，内异康复片中剂量组和丹莪妇康煎膏组与模型组比较差异具有显著性(P<0.05)，各用药组之间比较差异无统计学意义。见表3。

在位内膜MVD的表达：光镜下见空白组在位内膜中MVD阳性物质呈深棕色表达分布；各用药组及模型组与空白组比较无明显差别，各组在位内膜MVD表达的半定量检测结果示：内异康复片高、中剂量组、丹莪妇康煎膏组与空白组比较无统计学意义(P>0.05)。丹那唑组与空白组及模型组比较差异具有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表1 各组大鼠异位和在位内膜VEGF、ENS表达水平的比较

注：a与模型组比较P<0.01；b与模型组比较P<0.05；c与空白组比较P<0.05；d与丹那唑组比较P<0.05。

表2 各组大鼠异位和在位内膜V/E比值的比较

注：a与模型组比较P<0.05。

表3 各组大鼠异位和在位内膜MVD表达水平的比较

注：a与模型组比较P<0.01；b与模型组比较P<0.05；c与空白组比较P<0.05。

表4 各组大鼠异位和在位内膜微血管数目的比较

注：a与模型组比较P<0.01；b与模型组比较P<0.05；c与空白组比较P<0.01。

2.4 对异位和在位内膜微血管数目的比较

内异康复片高、中剂量组、丹那唑组、丹莪妇康煎膏组均明显降低异位内膜微血管数目，与模型组比较差异均有统计学意义(P<0.05),其中内异康复片高剂量组、丹那唑组与模型组比较差异具有极显著性(P<0.01)。模型组、内异康复片高、中剂量组、丹莪妇康煎膏组与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05),各用药组之间无统计学差异。丹那唑组与空白组比较差异具有极显著性(P<0.01)。见表4。

3 讨论

EMT是一种常见的妇科疾病，尽管其发病机理不清，但越来越多的证据表明，异位内膜的种植和生长依赖于足够血液供应的建立和维持，新生血管形成(angiogenesis)是EMT发生发展的关键步骤。血管形成是促血管形成因子和抑制因子协调作用的复杂过程，正常情况下二者处于平衡状态，一旦此平衡打破就会激活血管系统，使血管生成过度或抑制血管系统使血管退化。有研究发现EMT患者异位病灶及其腹腔液中多种血管生长因子明显增高，子宫内膜血管内皮细胞增生活跃，血管形成旺盛[3]，在同一期别中，无论是增生期还是分泌期，异位子宫内膜的血管密度及面积和其微血管密度均高于在位子宫内膜和正常子宫内膜[4]。

EMT的治疗至今仍十分棘手，西药主要采用激素类药物治疗，近年来采用的促性腺激素类似物治疗，虽然有较好疗效，但其对性腺轴有明显的抑制作用，异位内膜萎缩的同时在位内膜亦受影响。随着血管生成在EMT发病机制中发挥的重要作用逐渐被认识，有学者已开始着手于抗血管生成的治疗研究，其直接作用于血管内皮细胞的血管生成抑制因子，有更强的针对性，避免了对机体内性激素水平的影响[5]。有学者发现小柴胡汤具有糖皮质素样作用，通过下调糖皮质激素受体，降低细胞雌激素受体(ER)和雄激素受体(AR)含量，继而削弱雌激素的作用，降低VEGF水平[6]；理气胶囊(柴胡、白芍、制香附、莪术等)可能通过抑制雌、孕激素的分泌，降低VEGF的生成[7]；内异方(桃仁、三棱、莪术、桂枝、鳖甲、夏枯草、生大黄)能使异位内膜组织VEGFmRNA表达水平明显低于模型组，且随着加样量的增加，不同愈加明显[8]。

“血瘀内阻”是公认的EMT的根本病机，本研究结合四川盆地地域特点提出“湿热瘀结”亦是本病主要病机之一。EMT病变位于盆腔属下焦，瘀血留着，阻滞气机，气滞水停，水湿内聚或复感湿热，又可影响气血运行，滞而成瘀，湿热瘀血二邪互为因果，则渐成癥积且反复难消。针对上述病机，以清湿化瘀，行气止痛，消癥散结为治法，以《金匮要略》下瘀血方结合临床经验组方形成了医院制剂“内异康复片”处方，由大血藤、半枝莲、大黄、桃仁、土鳖虫、鳖甲、薏苡仁等组成。通过本实验研究，发现内异康复片高、中剂量组均能显著降低EMT大鼠异位内膜VEGF的表达、MVD值和微血管数目，并增加ENS的表达水平，由此可初步得出以下结论，内异康复片可能通过调节异位内膜血管生成过程，抑制了异位内膜血管的生成，促进了异位内膜的萎缩而达到治疗作用。本实验结果同时显示，内异康复片高、中剂量组可下调EMT大鼠在位内膜VEGF和上调ENS的表达，但V/E值、MVD及微血管数目的表达与空白组比较无统计学意义，即未破坏血管内皮刺激因子与抑制因子之间的动态平衡，对血管生成过程无影响。由此可初步推断，内异康复片治疗EMT在有效抑制异位内膜血管生成的同时，对在位内膜正常的血管生成过程无影响，这亦是中医药治疗EMT特色和优势的体现。

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