巯甲丙脯酸生物黏附型缓释胶囊大鼠体内药动学研究Δ

宋益民，范鸣浩，张丽，张学成（.青岛科技大学制药工程系，青岛市 6604；.中国海洋大学生命学院，青岛市 66003）

目前临床常用的治疗高血压和充血性心力衰竭的第1代血管紧张素Ⅰ转化酶抑制剂是水溶性的巯甲丙脯酸（Captopril，Cap）的糖衣片或普通片[1，2]，由于Cap生物半衰期仅为1.9 h，需要日服3～4次，当其摄入总量达到37.5～75.0 mg时作用仅可维持6～8 h[3]；若单剂量口服50 mg，峰浓度可达600 μg·L－1以上[4]，而其治疗浓度为50 μg·L－1。由于存在如此显著的峰-谷差异，使得Cap普通制剂使用后易引起眩晕、头疼、胃肠道紊乱等不良反应。此外，该药在胃内偏酸的环境中稳定而在肠道内偏碱的环境中易分解，且胃及小肠上部为其主要吸收部位[5，6]。考虑到胃肠道生物黏附型制剂（Gastrointestinal bioadhesion drug delivery system，GBDDS）具有延长药物在消化道释放时间，在胃及小肠上部定位释放药物，从而改善药物吸收，提高药物的生物利用度的特性，笔者以壳聚糖、明胶为载体材料，羟乙基甲基纤维素为生物黏附材料，制备了Cap生物黏附型缓释胶囊（Captopril bioadhesion sustained release capsules，CBSRCs）。研究结果表明，CBSRCs与Cap普通片相比具有良好的胃肠道黏附特性和明显延缓Cap释放作用[7]。在本文中，笔者进行了CBSRCs与市售Cap普通片在大鼠体内的药动学行为的比较，以期为CBSRCs的临床应用提供实验依据和理论基础。

1 材料

1.1 试药

Cap生物黏附型缓释胶囊（青岛科技大学制药工程系制备，规格：每粒30 mg）；Cap对照品（潍坊制药有限公司，纯度：99.5%）；Cap普通片（Captopril ordinary tablet，COT，青岛国风集团黄海制药有限责任公司，批号：020318，规格：每片25 mg）；对溴苯乙酰基溴（p-Bromophenacyl bromide，p-BPB，美国Sigma公司，纯度：99%）；硫代水杨酸（Thiosalicyclic acid，TA，瑞士Fluka公司，纯度：98%）；内标：对溴苯乙酸邻羧基苯硫酸酯（TA-p-BPB，青岛科技大学制药工程系制备，纯度98.5%）；乙腈为色谱级；乙二胺四乙酸（Ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）等均为分析纯。

1.2 动物

Wistar大鼠30只，♀♂各半，体质量（250±20）g，由青岛市立医院实验动物中心提供（鲁动质字20040627）。

1.3 仪器

LC-10Avp高效液相色谱（HPLC）系统，包括LC-6Ad高效输液泵、SPD-10Avp紫外检测器、SILvp-10ADvp全自动进样器、CTO-10Avp柱温箱、DGU-14A脱气机、SCL-10Avp系统控制器、CLASS_VP5.01色谱工作站（日本岛津公司）；WH-3型旋涡混合器（上海沪西分析仪器厂）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Waters Symmetry C18（150 mm×4.4 mm，5 μm）；流动相：乙腈-水-冰乙酸（45∶55∶0.2，V/V/V）；流速：1 mL·min－1；柱温：20 ℃ ；检测波长：258 nm，灵敏度：[Auxiliary：2；Range：1；Response：4]；进样量：10 μL。

2.2 内标的制备

按文献[8]方法并经改良，精密称取TA 0.44 g，p-BPB 0.95 g，加入60 mL甲醇溶解，1 mol·L－1NaOH调节pH 至7.0，于72℃水浴回流1 h，蒸发至10 mL，磷酸盐缓冲液（pH 7.0，60 mL）溶解，乙醚（60 mL）洗涤2次，水层加入1 mol·L－1HCl（8 mL），调节pH 至2.0，再用乙醚（60 mL）萃取2次，有机层合并，氮气吹干，得透明油状物即内标TA-p-BPB。

2.3 给药及血样采集

采用2组制剂单周期试验设计方法。30只Wistar大鼠随机分为2组，第1组先灌胃CBSRCs 0.1 g·kg－1（含Cap 5 mg·kg－1），第2组灌胃COT 0.02 g·kg－1（含Cap 5 mg·kg－1）。实验前禁食12 h，灌胃给予CBSRCs或COT 2 h后投食，不限饮水，分别于给药前和给药后0.25、0.50、1.0、1.50、2.0、3.0、4.0、6.0、8.0、12、16 h于眼眶后静脉丛各采血约0.5 mL，肝素抗凝（125 IU，pH 7.0），加入0.1 mol·L－1抗坏血酸和0.1 mol·L－1EDTA各10 μL，以3000 r·min－1离心10 min，分离血浆。

2.4 血浆样品的处理与测定

取血浆0.2 mL 加入 p-BPB（1 mg·mL－1）4 μL漩涡混合后，避光室温放置30 min后，加入内标TA-p-BPB（1.6 mg·mL－1）溶液20 μL，震荡30 s，室温放置30 min，置于－24 ℃冷冻保存，待测。

取衍生化反应完成后的血浆，分别加入1 mol·L－1HCl溶液40 μL及乙酸乙酯0.6 mL震荡2 min，离心10 min，分离出上层，加入0.1 mL稀碳酸钠水溶液（饱和碳酸钠与水的比例为1∶25，V/V），震荡2 min，离心10 min，弃去上层，加入1 mol·L－1HCl溶液0.4 mL，乙酸乙酯0.6 mL，再震荡2 min，离心10 min，分离出上层，于40℃水浴中氮气吹干，残留物用50 μL流动相溶解后进样。

2.5 稳定性考察

Cap在血浆中不稳定，4℃下处理后的血浆样品放置40 min后血浆中Cap含量即明显下降，因此采集的血样应立即离心分离出血浆，并加入衍生化试剂。解冻循环以及血浆样品－20℃冷冻放置试验显示，血浆中衍生物在－20℃条件下，放置2 d内稳定，所以采血后应保存在－20℃条件，并应在2 d内测定。

2.6 HPLC方法验证

2.6.1 血浆中Cap标准曲线的制备。取空白血浆0.2 mL，分别加入Cap 对照品，使其浓度分别为12.5、25、50、100、200、400、800 μg·L－1，然后加入4 μL p-BPB（1 mg·mL－1），按“2.4”项所述方法操作，每一浓度进行5样本分析，进样10 μL，记录色谱，以样品峰面积（As）与内标峰面积（Ai）的比值（Y）与Cap浓度（X）进行直线回归，求得方程 Y＝0.0065X－0.0382（r＝0.9987，n＝5）。根据标准曲线，确定Cap血浆浓度测定的线性范围为12.5～800 μg·L－1，最低检测限为12.5 μg·L－1。

2.6.2 回收率和精密度试验。取空白血浆3份分别加入Cap对照品，制备Cap 血浆使之浓度分别为 25、400 、800 μg·L－1，按“2.6.1”项下操作进样测定，计算回收率结果见表1。

表1 回收率试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery test（，n＝5）

表1 回收率试验结果（，n＝5）Tab 1 Results of recovery test（，n＝5）

相对回收率/%101.68±2.5298.30±2.0498.21±2.01浓度/μg·L－1 25400800测定值/μg·L－1 25.42±0.63393.2±8.17785.68±16.08

结果，平均回收率为99.40%。

在同日内于不同时间按“2.6.1”项下操作进样测定各7次，计算日内RSD；连续7d在同一时间测定每份样品，计算日间RSD，结果见表2。

表2 精密度试验结果（，n＝7）Tab 2 Results of precision test（，n＝7）

表2 精密度试验结果（，n＝7）Tab 2 Results of precision test（，n＝7）

日间RSD/%8.603.462.46浓度/μg·L－1 25400800日内测定值/μg·L－1 25.80±1.79393.40±11.19797.62±16.99日内RSD/%6.942.852.13日间测定值/μg·L－1 25.20±2.17391.22±13.54795.54±19.63

2.6.3 干扰试验。取大鼠空白血浆、空白血浆+Cap+内标和给予CBSRCs后血浆样品+内标进样分析，色谱结果见图1。

由图1可见，在选定的色谱条件下，Cap衍生物和内标分离效果良好，表明血浆中的内源物质对药物测定无干扰。内标衍生物的保留时间为（5.88±0.43）min，Cap衍生物的保留时间为（3.67±0.05）min，且样品峰与杂质峰的分离度大于1.5。

2.7 数据处理

所获得实验数据用DAS2.0药动学软件进行房室模型拟合，比较各房室模型的AIC值，按AIC最小值标准选择最佳房室模型，计算出相应的药动学参数，Cmax、tmax采用实测值，以非室模型统计矩计算AUC0～t、AUC0～∞、MRT，用配对比较t检验比较2种制剂的药动学参数。

图1 高效液相色谱图A.空白血浆；B.空白血浆+Cap+内标；C.给予CBSRCs后血浆样品；1.Cap衍生物；2.内标衍生物Fig 1 HPLC chromatogramA.blank plasma；B.blank plasma+Cap+internal standard；C.plasma sample after rats given CBSRCs+internal standard；1.Cap derivate；2.internal standard derivate

2.8 药动学结果

大鼠单剂量口服2种制剂后的血药浓度-时间曲线详见图2；各数据经DAS2.0程序处理，符合二室模型，主要药动学参数详见表3。

图2 2种制剂给药后血药浓度-时间变化情况Fig 2 Plasma concentration-time curve of two preparations

表3 2种制剂给药后药动学参数结果（，n＝15）Tab 3 The pharmacokinetic parameters of two preparations after medication（，n＝15）

表3 2种制剂给药后药动学参数结果（，n＝15）Tab 3 The pharmacokinetic parameters of two preparations after medication（，n＝15）

由表3可见，CBSRCs与COT 相比，t1/2β、AUC0～t、AUC0～∞、CL、Vd、tmax、Cmax差异具有显著性（P＜0.05或P＜0.01）。

参数CBSRCsCOT t1/2α/h1.88±0.381.15±0.21 t1/2β/h3.76±0.752.87±0.59 tmax/h3.12±0.671.53±0.27 Cmax/μg·L－1722.97±133.681114.47±208.36 CL/L·h－12.87±0.513.43±0.67 Ka0.53±0.091.99±0.37 Vd/L10.98±1.9013.21±2.57 AUC0～t/μg·h·L－14856.03±835.464616.29±915.49 AUC0～∞/μg·h·L－15218.39±1037.584705.83±894.56 MRT0～t/h5.53±1.033.71±0.66 MRT0～∞/h6.63±1.214.02±0.76

3 讨论

本文建立了HPLC-紫外检测器法作为口服CBSRCs后检测大鼠血液中Cap浓度的方法。由于Cap的化学结构中缺乏对紫外和可见光具特征吸收的基团，其本身的紫外吸收很弱，因此不能用HPLC-紫外检测器直接检测。而采用柱前衍生化使Cap与p-BPB生成具有较强紫外吸收的Cap-p-BPB后，可以明显提高测定Cap的灵敏度。经验证，该法具有良好的灵敏度和准确性，完全符合药动学研究的要求，并与文献[9]报道相一致。

本文采用随机分组单剂量给药的方案，测定了大鼠口服自制的CBSRCs和市售COT后的血药浓度，并计算了t1/2α、t1/2β、tmax、Cmax、CL、Vd、AUC0～t、AUC0～∞、MRT0～t、MRT0～∞等主要药动学参数。结果表明，CBSRCs与市售COT在大鼠体内的药动学特征差异具有显著性，CBSRCs的t1/2β、AUC0～t、AUC0～∞值明显高于COT，CL、Vd均显著低于COT，这与CBSRCs缓慢释放药物的性质有关，因而口服CBSRCs后在体内可维持较长时间有效血药浓度。CBSRCs达峰时间滞后于COT近2 h，峰浓度仅为COT的64.79%；CBSRCs的Ka值显著小于COT，体内MRT0～t、MRT0～∞显著延长，说明CBSRCs明显延长了制剂在大鼠体内的存在过程，具有较好的滞留和缓释作用。

与市售COT相比，大鼠口服CBSRCs后，显著改善了Cap原药的药动学性质，具有缓释和长效的作用。

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