复方钾钙镁液中细菌内毒素检查法的可行性研究

蔡 慎，郑英丽，陈宝玲，方 丽

（中国医学科学院阜外心血管病医院药剂科，北京市 100037）

1975年St.Thomas首次将心脏停跳液引入临床[1，2]，我院在此基础上于1980年研制出复方钾钙镁液，用于心脏直视手术前的心脏停跳。经20余年临床实践证明，该液未见明显不良反应，广泛应用于心外科手术中。目前国家对于注射剂质量高度关注，《化学药注射剂安全性检查法应用指导原则》规定注射剂均应设细菌内毒素（或热原）检查项。为了更有效地控制制剂质量，保证临床用药的安全，本文对该液进行了细菌内毒素检查的方法学研究，以期为建立其内毒素检查方法提供依据，同时也希望能为其他同类制剂的质量控制提供参考。

1 材料

鲎试剂（TAL，湛江博康海洋生物有限公司，批号：0802290，规格：每支0.1 mL，灵敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批号：0806181，规格：每支0.1 mL，灵敏度：0.25 EU·mL－1；湛江安度斯生物有限公司，批号：0903131，规格：每支0.1 mL，灵敏度：0.03 EU·mL－1）；细菌内毒素工作标准品（中国药品生物制品检定所，批号：150601-200963，规格：每支120 EU）；细菌内毒素检查用水（湛江博康海洋生物有限公司，批号：090511，规格：每支2 mL，内毒素含量：＜0.005 EU·mL－1）；复方钾钙镁液（自制，批号：20090305、20090326、20090423，规格：每支10 mL，含氯化钾0.3725 g、氯化钙0.145 g、氯化镁1.625 g）。

2 方法与结果

2.1 鲎试剂灵敏度复核试验

按照《中国药典》2005年版二部附录细菌内毒素检查法[3]规定，根据鲎试剂标示灵敏度，将细菌内毒素工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解，在旋涡混合器上混合15 min，然后，制备成2、1、0.5、0.25 λ 4个浓度的内毒素标准溶液。同时用细菌内毒素检查用水2支作为阴性对照管（记作NC）。鲎试剂灵敏度复核结果见表1。

从表1可见，3批鲎试剂灵敏度的测定值（λc）均在0.5～2.0 λ范围内，表明各批鲎试剂灵敏度符合规定。

2.2 细菌内毒素限值的确定

按公式L＝K/M[3]，K为人用每kg体质量每小时最大可接受的内毒素剂量，注射剂K＝5 EU·（kg·h）－1。M为以成人用每kg体质量每小时的最大供试品剂量，人均体质量按60 kg计算。本品在临床使用中，于500 mL生理盐水中加入本品10～20 mL，将其向心肌灌注。时间以1 h计；因此用药的最大剂量M＝0.33 mL/（kg·h）－1，计算得内毒素限值L为L＝K/M＝5/0.33＝15 EU·mL－1。因本品与大输液联合使用，为保证临床应用的安全性，根据复方、输液、工艺易污染者从严原则，加上安全系数。在上述计算限度基础之上将限度要求提高3～10倍[4，5]，因此将本品L值定为1.5 EU·mL－1。

2.3 干扰预试验

2.3.1 复方钾钙镁液有效稀释倍数（MVD）的计算。用MVD＝CL/λ来确定MVD，其中L为复方钾钙镁液的细菌内毒素限值1.5 EU·mL－1，λ为鲎试剂的标示灵敏度，目前购买到的鲎试剂灵敏度（λ）的范围一般在0.03～0.5 EU·mL－1，则本品的最大有效稀释倍数为3～50倍。

2.3.2 试验操作。将复方钾钙镁液用细菌内毒素检查用水分别稀释为3、6、12、24倍稀释液，将此系列稀释溶液记为NPC。根据使用鲎试剂的灵敏度，在上述试验溶液中加入细菌内毒素标准溶液，使每一浓度的试验液中均含有2 λ浓度的细菌内毒素，记此系列溶液分别为PPC。取灵敏度为0.25 EU·mL－12个不同厂家的鲎试剂，分别与上述PPC和NPC进行反应，每一倍数重复2管，并另取细菌内毒素检查用水和含2 λ的内毒素溶液分别作2支阴性对照（NC）管和阳性对照（PC）管。进行3个批号样品预干扰试验，结果见表2。

表2 样品干扰预试验结果Tab 2 Results of interference pretest for samples

预试验结果初步表明，2个厂家的鲎试剂对3批样品的细菌内毒素的试验结果均在供试品6倍及其以上稀释倍数时对鲎试剂的凝胶化反应不存在干扰作用。

2.4 干扰试验

为了最终确认是否存在干扰因素的影响，进行以下正式干扰试验。取复方钾钙镁液用细菌内毒素检查用水分别进行稀释，使其最终干扰试验稀释倍数为6倍，按《中国药典》2005年版二部附录中的“细菌内毒素检查供试品干扰试验项”[3]进行试验，结果见表3。

表3 样品干扰试验结果Tab 3 Results of interference test for samples

由表3可见，3个批号复方钾钙镁液对2个厂家鲎试剂的干扰试验结果，最大浓度2.0 λ管结果均为阳性，最低浓度0.25 λ管结果均为阴性；对于λ＝0.25 EU·mL－1的2组鲎试剂的Es均为0.25 EU·mL－1，在0.5～2.0 λ范围内，3个批号样品测得的的Et值均在0.5 Es～2.0 Es范围内，结果表明该样品进行6倍稀释后，对不同厂家的鲎试剂与内毒素的反应均无干扰作用，在低于或等于此浓度的情况下即可使用细菌内毒素检查法。

2.5 细菌内毒素半定量分析方法的确立

本品经过干扰试验验证稀释6倍后无干扰。计算：MVD＝CL/λ＝1.5/0.03＝50倍。用细菌内毒素检查用水将本品分别稀释为6、12、24、48倍。用灵敏度λ为0.03 EU·mL－1的鲎试剂作内毒素检查，按《中国药典》2005年版二部附录的凝胶半定量检测规定[3]进行。得到同样的反应终点浓度结果，详见表4。

表4 3批样品半定量分析结果Tab 4 Results of semi-quantitative analysis for 3 batches of samples

由表4可见，阴性对照溶液结果为阴性，样品阳性对照结果为阳性，系列溶液的反应终点浓度的几何平均值均在规定的范围之内，其符合试验有效的条件成立，故本试验结果有效。按照公式CE＝lg－1（∑X/2）计算内毒素浓度，得3批样品内毒素含量分别为0.36 、0.36、0.255 EU·mL－1，均小于1.5 EU·mL－1。故半定量法可以反映出细菌内毒素的真正含量。

3 讨论

适合鲎试剂反应水平的pH值范围为6.8～8.0，药物pH值过于偏酸或偏碱，超出了鲎试剂缓冲能力就可抑制或促进凝聚的形成[6]。本品的pH值范围为4.80～5.20，对细菌内毒素检查法存在干扰，经用2个厂家鲎试剂对样品分别进行干扰试验发现，当稀释至6倍时，在鲎试剂灵敏度为0.25 EU·mL－1时均不对试验产生干扰作用。通过试验结果证实了此干扰作用可通过稀释样品而消除。使用细菌内毒素半定量分析法，可以将供试品溶液中的细菌内毒素的量确定在某一小范围之内。本试验结果表明，选择适当浓度的稀释液按半定量法进行试验，可以直观地计算出其细菌内毒素近似含量。本品3批细菌内毒素含量均小于其限值1.5 EU·mL－1。

复方钾钙镁液是我院非法定制剂，《中国药典》尚无其内毒素检查的标准，为此笔者通过试验建立了复方钾钙镁液内毒素检查的方法，其细菌内毒素限值可定为每毫升复方钾钙镁液中含内毒素的量应小于1.5 EU。

[1]Braimbridge MV，Chayen J，Bitensky L，et al.Cold cardioplegia or continuous coronary perfusion?[J].J Thorac Cardiovasc Surg，1977，74（2）：900.

[2]Hearse DJ，Braimbridge MV，Jynge P.Protection of the ischemic myocardium：cardioplegia[M].New York：Raven Press，1981：341～352.

[3]国家药典委员会编.中华人民共和国药典（二部）[S].2005年版.北京：化学工业出版社，2005：附录85.

[4]国家食品药品监督管理局药品审评中心.药品技术评价文集（第二辑）[M].第1版.北京：中国医药科技出版社，2008：196～200.

[5]黄清泉，夏振民.药品细菌内毒素检查的实验设计[J].中国药学杂志，1997，32（2）：72.

[6]周学琴，张 丽，王迎春.果糖二磷酸钠注射液细菌内毒素检查法的研究[J].中国药房，2004，15（4）：242.