琥珀酸亚铁片3种含量测定方法的比较Δ

孙祥德，董 丽，席荣英

（新乡医学院药学院，新乡市 453003）

琥珀酸亚铁片是补铁的常用制剂，其主要成分为琥珀酸亚铁。目前，该制剂尚未被《中国药典》收载，地方标准是用氧化还原滴定法（硫酸铈法）测定含量。文献报道[1～5]不少其它的补铁制剂常用分光光度法，但尚未见分光光度法和高效液相色谱（HPLC）法测定琥珀酸亚铁片含量的报道。容量分析、光谱分析和色谱分析是药物制剂最主要的含量测定方法，虽然滴定分析法操作简便、准确度较高，但与光谱法和色谱法相比，其专属性较差，测定结果易受制剂中附加剂的干扰。为此，本文建立了分光光度法和HPLC法测定琥珀酸亚铁片含量的2种新方法，并将2种方法的测定结果与硫酸铈法进行比较分析，以期为该制剂的质量控制提供更全面、简便、快速、准确的方法。

1 材料

1.1 仪器

LC-6AD HPLC仪、SPD-20A紫外检测器（日本Shimadzu公司）；XK96-A快速混合器（姜堰市新康医疗器械有限公司）；pHS-3C精密pH计（上海精密科学仪器有限公司）；T6紫外分光光度计（北京普析通用仪器有限公司）。

1.2 试药

磷酸二氢钾、磷酸、硫酸亚铁铵、硫酸铈、醋酸铵、醋酸、邻二氮菲、乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA）均为国产分析纯试剂；琥珀酸对照品（系用国产分析纯琥珀酸试剂在乙醇中重结晶提纯制得，纯度：＞99.8%）；琥珀酸亚铁片（金陵药业股份有限公司南京金陵制药厂，批号：070302、070310、070512，规格：每片0.1 g，含量：含铁（Fe2+）34.0%～36.0%）；试验用水为自制二次蒸馏水。

1.3 试液制备

0.1 mol·L－1硫酸铈标准溶液：称取硫酸铈约42 g，加入含有28 mL硫酸的水500 mL，加热溶解后，放冷，加水适量使成1000 mL，摇匀。用基准三氧化二砷标定其准确浓度。

邻二氮菲指示液：取硫酸亚铁0.5 g，加水100 mL使溶解，加2滴硫酸与0.5 g邻二氮菲，摇匀即得。本液应在使用时新鲜制备。

Fe2+对照品溶液：称取硫酸亚铁铵0.1486 g，置于250 mL棕色容量瓶中，加水溶解后，加盐酸（1→2）0.30 mL，用水稀释至刻度，摇匀，作为贮备液。临用前，准确量取贮备液2.50 mL置于50 mL棕色容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得（每1 mL相当于0.004244 mg的Fe2+）。

邻二氮菲溶液（1.2 g·L－1）：取邻二氮菲60 mg，加50 mL水溶解，即得。

pH 4.20缓冲液：称取乙酸铵125 g溶解于约75 mL蒸馏水中，用冰乙酸调pH值为4.20，再用水稀释至500 mL，即得。

2 方法与结果

2.1 硫酸铈法

取本品20片，除去薄膜衣后精密称定，研细，精密称取适量（约相当于琥珀酸亚铁0.5 g），加稀硫酸20 mL和水30 mL的混合液，振摇使琥珀酸亚铁溶解后，加邻二氮菲指示液2滴，立即用硫酸铈滴定液滴定，并将滴定结果用空白试验校正。每1 mL硫酸铈滴定液（0.1 mol·L－1）相当于5.585 mg的Fe2+。

2.2 分光光度法

2.2.1 标准曲线的制备。移取Fe2+对照品溶液0、1.0、2.0、5.0、10.0、15.0、20.0、30.0 mL置于一系列50 mL容量瓶中，各加入邻二氮菲溶液2 mL，缓冲液10 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。5 min后，在分光光度计510 nm波长处，以试剂空白作参比，测定吸光度。以浓度（C）对吸光度（A）作线性回归，得标准曲线方程为C＝5.4142A－0.00266（r＝0.9998），Fe2+的检测浓度线性范围为0.04244～2.546 mg·L－1。

2.2.2 精密度试验。制备2.546、0.8488、0.04244 mg·L－13个浓度的对照品溶液，各溶液于同日内重复测定吸光度5次，代入标准曲线方程计算Fe2+浓度及日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度。结果，日内RSD均小于1.0%，日间RSD均小于1.90%。

2.2.3 方法回收率试验。取“2.2.4”项下供试品溶液，准确加入适量的Fe2+对照品溶液，测定Fe2+，计算加样回收率。结果，平均回收率为99.5%。

2.2.4 Fe2+含量测定。取本品20片，除去薄膜衣后精密称定，研细，精密称取约半片质量的样品粉末置于50 mL容量瓶中，加水适量，超声溶解20 min，过滤。准确量取续滤液2.0 mL至50 mL容量瓶中加水至刻度，得供试品溶液。取供试品溶液10.00 mL于50 mL容量瓶中，加入3%EDTA溶液5 mL，邻二氮菲溶液2 mL，缓冲溶液10 mL，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀。5 min后，在分光光度计510 nm波长处，以试剂空白作参比，测定吸光度。供试品、对照品及不含琥珀酸亚铁的空白辅料溶液的吸收光谱曲线见图1。

图1 紫外吸收光谱1.对照品；2.供试品；3.空白辅料Fig 1 UV absorption spectrum1.reference；2.sample；3.blank excipients

2.3 HPLC法

2.3.1 色谱条件。色谱柱：大连依利特Sinochrom ODS-BP（200 mm×4.6 mm，5 μm）；预柱：C18（25 mm×4.6 mm）；流动相：0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.50）；检测波长：215 nm；流速：1.0 mL·min－1；柱温：25 ℃；进样量：20 µL。

2.3.2 标准曲线的制备。精密称定琥珀酸对照品适量，加流动相溶解，制备成浓度为32.2 mmol·L－1的琥珀酸对照品溶液，用流动相依次等体积稀释，得到一系列浓度不等的对照溶液。分别取上述系列对照液20µL进样。以浓度（C）对相应的峰面积（A）作线性回归，得标准曲线方程为C＝1.5145×10－5A+0.1706（r＝0.9990），琥珀酸检测浓度线性范围为0.25～32.2 mmol·L－1。

2.3.3 精密度试验。制备32.2、4.00、0.25 mmol·L－13 个浓度的对照品溶液，各溶液同日内重复进样5次，计算日内精密度；连续测定5 d，计算日间精密度。结果，日内RSD均小于1.5%，日间RSD均小于2.1%。

2.3.4 方法回收率试验。取“2.3.5”项下供试品溶液，准确加入适量的琥珀酸对照品溶液，测定加样回收率，结果平均回收率为99.8%。

2.3.5 样品含量测定。取本品20片，除去薄膜衣后精密称定，研细，精密称取约2片质量的样品粉末于100 mL容量瓶中，加适量流动相，超声20 min，用流动相稀释至刻度，0.45µm微孔滤膜过滤，得供试品溶液，进样20µL。将测定的峰面积代入标准曲线方程计算。

在上述色谱条件下得到的琥珀酸对照品溶液和供试品溶液的色谱见图2。

图2 高效液相色谱图A.对照品；B.供试品；1.琥珀酸Fig 2 HPLC chromatogramsA.reference；B.sample；1.succinic acid

2.4 3种方法含量测定结果

3种方法测定每片琥珀酸亚铁片中Fe2+含量的结果见表1。

将本文建立的分光光度法测定结果与现行标准方法硫酸铈法测定结果在95%置信水平上进行F检验和t检验，结果表明2种方法的精密度和测定结果之间均无显著性差异。

3 讨论

邻二氮菲光度法是测定Fe2+浓度的常用方法，已有很多文献[1～5]报道以其测定不同类型样品中的Fe2+含量。其测定原理是在适宜的pH值条件下，Fe2+与邻二氮菲生成1∶3橙红色的稳定配合物，该配合物在510 nm波长处有最大吸收。本试验通过优化显色剂用量、显色时间、显色溶液pH值等条件，建立了邻二氮菲光度法测定琥珀酸亚铁片中Fe2+含量的测定方法。亚铁邻二氮菲配合物在较广泛的pH值范围内（pH2～9）都能稳定存在，但由于Fe2+在碱性介质中易被空气中的氧氧化为Fe3+，再者Fe2+在碱性较强的溶液中与OH－之间具有较强的配位副反应，而在微酸性介质中较为稳定，因此本试验选择在酸性介质中进行显色。结果表明，显色反应在pH 4.20的缓冲溶液中显色完全，配合物稳定性好。在上述显色条件下，配合物溶液的吸光度在显色5 min时达到最大且稳定。在测定Fe2+含量时，选用EDTA为掩蔽剂，可以有效地掩蔽Fe3+和其它高价金属离子对Fe2+测定的干扰。

表1 3种方法测定琥珀酸亚铁片中Fe2+含量的结果（n＝3）Tab 1 Results of content determination of three kinds of methods（n＝3）

HPLC测定的原理是基于琥珀酸中的羧基在215 nm波长处有紫外吸收而能被检测。琥珀酸亚铁中琥珀酸根离子与Fe2+的摩尔比为1∶1，通过测定琥珀酸根离子的量即可计算Fe2+的含量。固定甲醇比例调整不同pH值0.05 mol·L－1KH2PO4溶液，以及固定0.05 mol·L－1KH2PO4溶液pH值调整甲醇比例，从而选择合适的流动相。试验结果表明，当流动相中缓冲液的pH值大于2.80时，或者含有一定比例的甲醇时，琥珀酸都会出现多峰，或搭肩峰、峰前延、拖尾峰等，这可能是因为琥珀酸为二元酸，在溶液中因解离而以多种型体存在，各种存在型体的比例决定于溶液的pH值，因此，控制溶液的pH值以抑制其解离，是得到良好色谱峰的重要条件。本试验结果表明，当使用0.05 mol·L－1KH2PO4（pH＝2.5）溶液为流动相时，琥珀酸不仅以单峰出现，而且峰形良好。

琥珀酸亚铁片是一种含铁（Fe2+）34.0%～36.0%的无水碱式盐，其主要活性成分为琥珀酸亚铁。比较3种方法的测定结果可知，本文建立的邻二氮菲光度法的测定结果，与硫酸铈法的测定结果一致。2种方法测定琥珀酸亚铁片中亚铁含量的测定结果无显著性差异，说明2种方法均可用于该片剂的质量控制，但以光谱法的专属性较好，操作简便快速。因此，本文建立的邻二氮菲光度法可以替代现行标准中的硫酸铈法，用于琥珀酸亚铁片的含量测定。

HPLC法的测定结果明显小于其他2种方法（大约为其80%），这是因为琥珀酸亚铁片是一种含铁（Fe2+）的无水碱式盐，无确定的结构式和分子式，除了琥珀酸亚铁外，亚铁还有其他的存在形式，而HPLC是通过测定琥珀酸根离子来测定Fe2+的，所以，该法测定结果小于其他2种方法。因此，HPLC方法只能测定与琥珀酸根结合的亚铁，不能用于测定总的亚铁含量。琥珀酸亚铁为有机铁剂，具有不损伤胃黏膜、胃肠道反应较轻的特点[6]。本品在胃酸中解离出的琥珀酸能参与三羧酸循环和血红蛋白合成，而且可以促进亚铁离子的吸收[7]，是各种亚铁盐中吸收率较好者[8～10]。由此可见，琥珀酸亚铁是该制剂的主要的有效成分，利用HPLC测定其有效成分，对控制琥珀酸亚铁的生产工艺，确保其主要成分的含量，有着一定的应用价值。

总之，在本文所建立的2种新方法中，邻二氮菲光度法简便、快速、准确，可以替代硫酸铈法用于琥珀酸亚铁片的含量测定；而HPLC法虽不能测定总的亚铁含量，但可以测定其有效成分琥珀酸亚铁的含量，对优化生产工艺和全面控制本制剂质量具有一定的意义。

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