白蛋白酶联免疫分析试剂盒的研制

官国英,刘忠瑞,李丽波,侯惠仁,王晶晶,韩世泉

(中国原子能科学研究院同位素研究所,北京 102413)

白蛋白(Albumin,Alb)是血浆的主要成分,由肝脏产生,相对分子质量为66 300。当肾脏病变时,肾小球滤过膜通透性发生改变,孔径变大,Alb漏出,尿液中Alb升高。尿中白蛋白排出量的多少,可反映肾小球损伤的程度,是诊断肾小球肾病的灵敏指标。尿白蛋白测定用于肾脏病的早期诊断,也是目前检查糖尿病以及高血压患者肾脏早期损伤的最灵敏的方法之一[1-2]。尿白蛋白与β2-微球联合测定,可用于鉴别诊断肾脏损伤的部位。尿白蛋白测定在肾脏移植及肾小球药物损伤的监测等方面亦有一定的价值[3]。

传统的测定尿白蛋白的方法主要有放射免疫法、免疫比浊法、高效液相色谱法、酶联免疫法等。放射免疫法灵敏度、精确度较高,但是实验过程复杂,仪器昂贵;免疫比浊法简单方便,但是试剂昂贵,不适合大批量的样本筛选;高效液相色谱法处理过程复杂,操作过程繁琐,不适用于临床推广应用;酶联免疫法仪器简单,操作简便、快速,适用于临床检测和科研应用。

1 实验部分

1.1 主要仪器

酶标仪:奥地利SLT公司产品,电热培养箱:上海跃进医疗器械厂产品。

1.2 主要试剂

Alb、辣根过氧化物酶(H RP)、四甲基联苯胺(TMB)、过氧化氢(H 2O2):美国 Sigma公司产品;Alb多克隆抗体:原子高科股份有限公司产品。

2 实验方法

2.1 Alb酶标记物(Alb-HRP)的制备

采用高碘酸钠标记法对Alb进行酶标记[4-5]。称取1.0 mg HRP溶于0.1 mL双蒸水中,搅拌下加入0.1 mL新鲜配制的0.06 mol/L高碘酸钠(NaIO4)水溶液,4℃静置30 min;取出,搅拌下加入0.1 mL 0.16 mol/L乙二醇水溶液,室温静置30 min。将 0.5 mL(1.0 mg)Alb的水溶液加入上述溶液中,混匀后,装入透析袋对0.05 mol/L p H 9.5的碳酸盐缓冲液4℃透析过夜;次日,将溶液自透析袋取出,加入0.04 mL(5 g/L)新配制的NaBH 4蒸馏水溶液,混匀,4℃下静置2 h。取出反应液,装入透析袋对0.02 mol/L p H 7.4的PB 4℃透析过夜,取出透析液,此即为Alb-HRP。在透析液中加等体积甘油,于-20℃贮存备用。

2.2 固相抗体的制备

向聚苯乙烯微量滴定板孔中加入含有Alb多克隆抗体的p H9.6碳酸缓冲液(200μL/孔),置4℃冰箱内过夜,37℃封闭1 h,此酶标板可用于免疫反应。

2.3 Alb标准品的配制

用含0.2%BSA的0.01 mol/L,p H7.4的PBS将已知浓度的Alb浓液按要求依次稀释,配制成 1.0、2.0、5.0、10.0 、20.0 和 50 mg/L 的系列标准品,分装,冻干,4℃下贮存备用。

2.4 底物溶液和终止剂

将TMB和H 2O2分别溶于pH 5.0的柠檬酸-磷酸缓冲液中,使其浓度分别为 0.6、1.2 mmol/L,使用时以体积比1∶1混合,此即为底物溶液。终止剂为2 mol/L H2SO4溶液。

2.5 Alb-ELISA分析程序

采取一步法加样程序,以20μL/孔待测样品或标准品和200μL/孔酶标记物加入包被有Alb多克隆抗体的微量滴定板中,混匀,37℃温育40 min,弃反应液,用洗涤液(含 0.05%Tween-20)洗 5次,加入底物液 200 μL/孔,避光,37℃下显色 15 min,以 2 mol/L H 2 SO4溶液以每孔50μL终止显色,于450 nm处测定其光密度OD450。绘制标准曲线,计算样品中Alb含量。

3 结果与讨论

3.1 方法学建立

3.1.1 Alb-HRP滴度的选择

用含0.2%BSA的PBS将Alb-HRP稀释为 1∶2 000、1∶3 000、1∶4 000和 1∶5 000的工作液,用于Alb-ELISA实验,Alb的4个标准点为 0、1.0、20.0 和 50.0 mg/L,分别用 A 、B、F和G表示,其吸光度OD450及各标准点与A点的吸光度之比(B/B0)列于表1。分析表1可知,Alb-HRP滴度为1∶3 000时,标准点B、F、G 与A 的 B/B0分别为 81.5%、20.0%、11.8%,说明曲线的抑制效果好,可以满足免疫分析的要求。

3.1.2 标准品和 Alb-HRP加样量对Alb-ELISA的影响

Alb的7个标准点(A 、B、C、D 、E、F和 G,浓度分别为 0、1.0、2.0、5.0 、10.0、20.0 和50.0 mg/L)和 Alb-H RP分别加样 20μL+200μL、50μL+150μL进行Alb-ELISA 实验,实验结果列于表2。表2显示,加样量为20+200 μL 时,B、C 、D 、E 、F 、G 点与 A 点的 B/B0分别为 82.7%、62.7%、39.1%、24.8、17.5、9.7%。此结果表明,标准曲线有较高的灵敏度,较好的抑制曲线,可以满足免疫分析要求。

表1 Alb-HRP滴度的选择

表2 标准品和Alb-HRP加样量对Alb-ELISA的影响

3.2 方法学鉴定

3.2.1 标准曲线与灵敏度

按照Alb-ELISA分析程序分析各标准点的OD450,以标准品的浓度为横坐标(对数坐标),OD450为纵坐标(普通坐标),在半对数坐标纸上绘出Alb-ELISA标准曲线,结果示于图1。同时测定20个零标准的OD450,以其平均值减去2s计算其分析灵敏度为0.28 mg/L。

图1 Alb-ELISA标准曲线

3.2.2 精密度

重复测定3份不同浓度的Alb样品,观察批内、批间变异,实验结果列于表 3。表3显示,批内变异为2.63%～5.28%,批间变异为2.40%～4.26%。该结果表明,本工作所研制的试剂盒的精密度满足免疫分析的要求。

表3 Alb-ELISA试剂盒的批内批间变异

3.2.3 准确性

取3份不同浓度的Alb样品分别加入已知浓度的Alb标准品中,测定Alb回收率,结果列于表4。表4显示,回收率为95.0%～106.4%,符合免疫分析要求。

表4 样品回收实验

3.2.4 稀释实验

取Alb含量较高的样品用Alb“零”标准进行倍比稀释,测定结果列于表 5。经计算,Alb测定值与稀释度线性相关方程为y=32.81x+0.72,相关系数为r=0.997 4,该结果符合免疫分析要求。

表5 样品倍比稀释实验

3.3 正常尿液样品的检测

采用所建立的白蛋白酶联免疫试剂盒检测52份正常人尿样品,测定结果显示,其白蛋白含量小于12 mg/L,与文献[6]基本一致,符合临床测定要求。

4 小 结

本试剂盒通过条件优化实验,找到合适的反应体系,建立了Alb酶联免疫分析方法,方法的分析灵敏度、精密度、准确性、临床测定值均达到免疫分析要求。

[1] 戴世荣.尿微量蛋白在糖尿病肾病中的应用价值[J].临床检验,2002,15(5):506.

[2] 陈玉霞,李凤敏,代军,等.尿微量白蛋白在高血压病肾损害诊断中的价值探讨[J].甘肃科技,2006,22(6):193-194.

[3] 王自正.现代标记免疫学[M].北京:人民军医出版社,2000:249.

[4] 郭春祥,郭锡琼.介绍一种简单、快速的辣根过氧化物酶标记物酶标记抗体的过碘酸钠法[J].免疫学杂志,1983,33:97-100.

[5] 刘佳宁,刘一兵,贾娟娟,等.促黄体生成激素酶促化学发光免疫分析方法的建立[J].同位素,2010,23(1):28-33.

[6] 朱敏,邵爱华,张哲,等.各种肾病患者尿微量蛋白测定结果观察[J].浙江中医学院学报,2003,27(5):31-32.