解磷根瘤菌液体培养基类型，浓度及透气条件的比较

李剑峰，张淑卿，师尚礼，霍平慧

(1.甘肃农业大学草业学院，草业生态系统教育部重点实验室，中-美草地畜牧业可持续发展研究中心，甘肃兰州 730070)

磷是植物生长发育不可或缺的重要元素，我国大部分区域土壤平均含磷量0.12%，但其在土壤溶液中的浓度一般仅有0.005～1.0 mg/kg，总量充足而可溶性磷含量匮乏，难以供植物直接吸收利用[1]，而施入土壤的化学磷肥利用率很低，通常只有5%～25%[2]。而解磷微生物产生的植酸酶，核酸酶和磷酸酶等加速了植酸、核酸、磷脂等含磷有机化合物的分解，这些有机酸可与无机磷进行螯合[3]，使土壤中的难溶性无机磷向可溶性磷转化[4]，是改善植物磷素营养，增加土壤中的可溶性磷[5，6]的重要途径。目前，对微生物参与难溶态磷素利用的研究多局限在芽孢杆菌(Bacillus megaterium)[7]和真菌、放线菌等方面，而对涉及解磷根瘤菌菌种培养和发酵的研究报道较少。祁娟等[8]在苜蓿种子中分离得到一株根瘤菌SL01，具备溶解难溶性无机磷的能力，有较好的利用价值和开发潜力，但解磷根瘤菌同其他微生物一样对特定的培养环境有特定的要求，不同的培养基类型和浓度下，菌种的发酵速度有很大的差异[9]，并且在根瘤菌制剂的不同工艺流程中，对菌株生长速度，发酵培养液的营养容量都有不同的要求。因此，研究拟通过对SL01菌株在不同类型和浓度培养基下的发酵速度和培养基的pH值变化进行比较和分析，以期得到适于SL01菌株液体发酵的种子培养基及发酵培养基。为解磷根瘤菌培养条件的研究及解磷根瘤菌制剂的生产提供参考和依据。

1 材料和方法

1.1 供试菌株及培养基

供试菌株为解磷苜蓿根瘤菌SL01，由甘肃农业大学草业生态系统重点试验室提供。

YMA培养基参考文献[10]的方法配制，KH2PO4 0.5 g ，酵母粉 1.0 g，甘露醇 10.0 g ，MgSO4.7H2O 0.2 g，NaCl 0.1 g，pH 值6.8～ 7.2，蒸馏水 1 000 mL 。YMA刚果红固体培养基[11]每升加10 mL 0.25%的刚果红溶液和15.0克琼脂。

牛肉膏蛋白胨培养基[12]:牛肉膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g ，水 1 000 mL ，pH 7.2。

LB培养基参考[12]:酵母膏 5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl10.0 g，蒸馏水 1 000 mL ，pH 值 7.0～7.2

按以上3种培养基配方分别配制含其完全培养基百分数为100%，50%和25%，共计6个类型的液体培养基。

仪器和设备采用英国Jenway公司生产的3305型pH计；WPA S2000型紫外/可见光分光光度计，T HC-C自动控温调速振荡生化培养箱

1.2 试验方法

1.2.1 培养基类型及浓度的筛选 将4℃下YMA斜面保存的SL01菌种连同试管斜面在28℃下活化24 h，将活化菌种接一环到装有50 mL液体培养基的250 mL三角瓶中，28℃，120 r/min避光培养，培养期间每2 h以分光光度计测定菌液OD600nm吸光度值，连续测定30 h。同时以pH计测定菌液pH值，每处理3次重复。

菌体含量的测定:参照唐勇等[13]及梁锦峰等[15]的方法在OD600nm测定菌液的吸光度值，以浊度法用600 nm的OD值表示发酵液的菌体含量。

1.2.2 透气条件的比较 在选择出适宜的发酵培养基后，在装有50 mL YMA液体培养基的150 mL三角瓶中接入菌株，以胶塞密封瓶口作为密闭培养处理，并以透气封口膜封装瓶口的处理作为透气培养。所有处理在28℃下120 r/min振荡培养，每处理4次重复。培养24 h后分别取各处理稀释1×104、1×106和1×108倍的菌液0.2 mL，均匀涂抹在9 cm直径的YMA刚果红固体平板上，28℃培养24 h，以稀释平板法测算每毫升菌液中的活菌含量，并选取单菌落数在30～300的固体平板，测定单菌落的直径。每处理6次重复。

1.3 数据分析

采用Excel软件进行数据整理，用DPS 3.0软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 根瘤菌培养基类型和浓度的选择

测定了SL01菌株在供试的3个类型共9种液体培养基中生长的OD值，并绘制曲线(图1)。菌株在LB和1/2 LB液体培养基中最先进入快速生长期，并将快速生长期分别维持到第28 h和26 h，说明菌株在这两种培养基中生长的速率显著高于在YMA和牛肉膏蛋白胨培养基中的生长速率(P＜0.05)，且30 h内的菌液OD值均显著高于其他液体培养基。但1/4浓度的LB培养基在14 h后营养基本消耗殆尽，菌液OD值不再变化。YMA完全培养基中，发酵菌液的OD值增高速率较LB培养基稍低，但对数期生长期较LB培养基更长，稳定期出现的较迟。1/2 YMA和1/4 YMA培养基中，菌液的OD值分别在22 h和26 h时趋于停滞，而YMA完全培养基发酵液的OD值则在30 h内始终增长。SL01菌株在牛肉膏蛋白胨培养基中生长最差，并很快达到稳定期和衰老期。

图1 不同液体培养基中的SL01菌株发酵液的菌体含量Fig.1 Rhizobia densities of SL01 strain in different liquid culture mediums

2.2 不同类型培养基SL01发酵菌液的pH值变化

通过测量发酵过程中的培养基酸度发现，所有培养液在最初6 h，pH值均随菌密度的增大而降低，表明SL01菌株在开始快速繁殖时产生了大量酸性物质，在6～12 h，YMA培养基发酵液持续变酸，LB培养基，1/2和1/4牛肉膏蛋白胨培养基发酵液的pH值却不断升高(图2)。菌株在对数期代谢旺盛，能够利用碳源和氮源产生大量的有机酸，在碳氮源均充足的条件下，随着菌体密度的增大，发酵液的pH值持续降低。当碳源不足时，部分菌体发生自溶现象，释放出胞内氨态氮等碱性物质，使得pH值上升[13]。故此，发酵液pH值的升高说明菌液中发生自溶的菌体数目增多，菌株的产酸代谢变缓。解磷根瘤菌分泌的大量有机酸使SL01菌株具备了溶解难溶性无机磷的特性。供试液体培养基中，YMA、1/2 YMA、1/4 YMA和牛肉膏蛋白胨培养基的碳源较为充足，使其发酵液的pH值始终降低。1/2、1/4的牛肉膏蛋白胨培养基则明显碳源不足，在发酵6 h后，菌液的OD值虽持续上升，但pH值明显上升。可见，发酵液中pH值的增高不利于菌株的生长和解磷。

充足的碳源不仅是解磷根瘤菌生长繁殖的必要条件，也促进了菌株的解磷能力。将SL01菌株接种于含过量难溶性无机磷(磷酸钙)和不同碳源含量的无磷液体培养基中，培养一定时间后，通过测定发酵菌液中的可溶性磷含量可以发现，充足的碳源能使SL01菌株的解无机磷能力发挥到最高水平，而在碳源不充足时，SL01菌株的解磷能力明显减弱。

图2 不同培养基发酵菌液的pH值变化Fig.2 pH value change of fermentation broth in different culture mediums

表1 培养透气对发酵菌液活菌含量和菌株单菌落直径的影响Table 1 Effects of ventilation condition on live rhizobia content and clone diameter of strains in fermentation

2.3 透气条件对发酵液内有效菌含量及菌种单菌落直径的影响

通过比较不同透气培养条件下SL01菌株发酵液的活菌量和菌株生长活性发现，透气培养24 h菌液中根瘤菌的活菌数目为密闭培养下的10.51倍，差异显著(P＜0.05)。透气条件下培养得到的菌种在YMA固体平板上的单菌落直径也显著大于密闭培养得到的菌种，说明发酵中的透气条件对于SL01菌株的繁殖速度和菌株单菌落生长速度有较大影响。

3 结论与讨论

(1)LB和1/2 LB培养基适宜用于溶磷根瘤菌SL01的快速发酵，在有限体积的菌液中能存活高密度的菌体，因此，适合于进行SL01菌株的快速发酵繁殖，用于种子培养基能有效的提高生产效率。但同时也由于菌株繁殖过快，LB培养基中的营养会在短时间内耗尽，使得菌体大量死亡，故不宜用于长期保存大量的菌种。YMA液体培养基由于能使发酵过程保持较长的快速生长期，菌株处于高增殖活力阶段的时间较长，故可用于保存大量的活菌，这一结论与尚军红等[14]的研究结果一致。

SL01菌株在3种类型不同浓度的液体培养基内的生长速率差异较大，但快速生长期阶段菌体的密度均与培养基的浓度间呈正相关，说明液体发酵培养中，菌株的繁殖速度不仅与培养基的类型有关，更受到营养条件的限制。

(2)不同类型的培养基接入解磷根瘤菌SL01并充分发酵之后，发酵液的pH值都相当程度的偏离了初始的酸碱度，这与梁锦峰[15]的研究结果不同，即溶磷菌培养物的终点pH值与初始pH值无明显的变化。这可能除了菌株本身原因外，合适的碳氮比也是一个非常重要的因素。碳氮比高的培养基经培养后pH值常会明显下降，而碳氮比低的培养基经培养后其pH则会明显上升[16]。Wenzelet[17]的研究表明，溶磷杆菌只有在培养基的pH下降到4左右时具有强烈的溶磷活力，而当培养基pH升高时则失去溶磷活性。以上结论表明，要使SL01菌株表现出较强的溶磷能力，充足的碳源是不可或缺的。其具体的变化过程仍有待进一步的研究。此外，根瘤菌作为好气菌，发酵培养的透气条件对菌株的增殖能力及菌种的活性密切相关，在解磷根瘤菌的发酵培养中，透气状况应作为重要的环节进行考虑。

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