木芙蓉提取物中芸香苷含量的高效液相色谱法测定

陈贞干, 唐小梅, 陈远道, 周诗彪



木芙蓉提取物中芸香苷含量的高效液相色谱法测定

陈贞干, 唐小梅, 陈远道, 周诗彪

(湖南文理学院 化学化工学院, 湖南 常德, 415000)

建立木芙蓉提取物中芸香苷含量的HPLC定量测定法. 以芸香苷标准品为对照进行反相高效液相色谱法测定：测定的色谱柱为nova-park C18(3.9×150 mm, 4 µm), 流动相为甲醇-1%醋酸溶液(50/50,/), 流速为1 mL/min, 用紫外检测器检测, 检测波长为254 nm. 芸香苷与木芙蓉中其他成分基线分离良好, 芸香苷在4.16~41.6 mg/L范围内, 峰面积与浓度呈良好线性关系(= 0.9993). 确定了精密度日内RSD在5.32%～6.02%.

高效液相色谱; 芸香苷; 木芙蓉

芸香苷又名芦丁、紫槲皮苷, 为黄色结晶粉末或无晶形粉末, 有苦味, 略溶于冷水, 能溶于热水、乙醇、甲醇[1-2]. 芸香苷可以直接作为药品, 也用于复配和药物的中间体. 目前, 我国芸香苷生产主要以槐米(槐花的花蕾)为原料进行提取[3]. 槐米因资源不足, 不能充分满足市场需求呈现出原料供应紧张现状. 本文试图从木芙蓉叶中提取芸香苷并采用高效液相色谱法测定其含量.

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

1.1.1 仪器

高效液相色谱仪(waters 1525 美国waters 公司生产), 配套的紫外检测器(waters 2487美国waters公司生产), 手动进样器(25µL), 十八烷基色谱柱(3.9×150mm, 4µm), 电子天平(BS201, 精确度1×10-5g, 德国赛多利斯公司生产), 超声波清洗仪(BS3200, 上海必能信公司), 恒温水浴锅、索氏提取器等.

1.1.2 试剂、原料

甲醇(AR、色谱纯)、冰醋酸(AR)、芸香苷对照品(中国药品生物制品检定所)、二次蒸馏水(自己制备)、木芙蓉叶(湖南文理学院内采摘).

1.2 芸香苷的提取

用电子天平精确称取木芙蓉叶约3g(精确到具体数值), 置于100 mL圆底烧瓶中, 再用量筒量取40 mL、60%的甲醇溶剂加入到圆底烧瓶中, 70 ºC水浴回流2.5 h左右, 趁热抽滤, 残渣用甲醇洗涤2～3次洗涤液并入滤液, 滤液再用定量滤纸过滤, 滤液用甲醇定容于100 mL容量瓶中, 再用移液管从中移取10 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容.

1.3 芸香苷含量的测定

1.3.1 芸香苷测定的色谱条件

用芸香苷标准溶液、样品溶液确定最佳的色谱条件：色谱柱为十八烷基柱, 流动相为甲醇-1%醋酸溶液(50/50,/), 流速为1.0 mL/min, 检测波长为254 nm进样量为10 µL, 室温条件下操作. 待仪器稳定后, 取样品液10 µL进样, 外标法定量, 测定样品中芸香苷的含量.

外标法峰面积定量, 在上述色谱条件下, 对照品与样品色谱图如下:

图1 芸香苷对照品

图2 木芙蓉叶提取物样品

1.3.2 标准曲线的确定

用电子天平精确称取芸香苷的标准样品0.0260 g, 用甲醇定容到250 mL, 然后用移液管分别移取1 mL、2 mL、4 mL、6 mL、8 mL、10 mL置于不同的25 ml容量瓶中, 甲醇稀释定容至刻度, 摇匀. 以峰面积对浓度(mg/L)作图, 得到相关线性方程.

表1 A(峰面积)—C(对照品浓度)关系试验

线性方程: A=15 086C-26 310; R=0.999 3; 线形范围: 4.16~41.6 mg/L

2 结果与问题讨论

2.1 芸香苷提取条件

2.1.1 索氏提取法的影响因素

现代色谱分析样品制备技术的发展趋势就是使处理样品过程要简单, 处理速度要快, 使用装置要小, 对欲测定组分的选择性和回收率要高.

本文采用简单的液—固多次萃取的方法(即索氏提取法)处理样品, 液-固萃取包括两个过程: 固体样品中某些欲测组分分子在溶剂中溶解过程和欲测组分分子与溶剂分子相互扩散的过程. 这两个过程实际上是同时进行的. 萃取时的扩散主要由分子扩散和对流扩散组成. 在固体样品表面与溶剂接触处为分子扩散, 而远离固体样品表面处为对流扩散, 在对流扩散中也有分子扩散. 对这两种扩散的综合分析表明, 影响液—固萃取的因素有萃取时的温度、溶剂的性质与用量以及萃取时间.

经过试验得到最优提取条件为60%甲醇水溶液作溶剂, 料剂比为1:15, 萃取温度为65～70 ℃,萃取时间为2.5 h, 收率为0.2%.

2.1.2 超声波提取的影响因素

超声波提取主要是利用超声的空化作用对细胞膜的破坏, 有助于有效成分的溶出与释放; 超声波使提取液不断震荡, 有助于溶质扩散; 同时超声波的热效应对原料有水浴作用. 影响超声提取的因素有超声波的频率和提取时间. 经试验得出采用超声波法提取木芙蓉叶中芸香苷的较佳工艺条件为: 原材料浸泡时间2.5 h, 超声波频率0.02 MHz, 超声空化震荡提取时间0.5 h, 收率为0.14%.

2.2 芸香苷高效液相色谱测定法

2.2.1 色谱条件的确定

芸香苷属于黄酮类化合物, 为极性化合物, 略溶于水易溶于极性溶剂甲醇, 可以选用反向色谱柱来分离测定. 据文献报道C18柱对黄酮类化合物能够有效的分离[4-6], 因此本实验选用C18柱. 将芸香苷的甲醇标准溶液在紫外分光光度计上进行扫描, 可得知芸香苷在190～600 nm范围内有2个特征吸收峰202、254 nm, 在202 nm处芸香苷吸收较254 nm处大, 但流动相1%醋酸溶液、甲醇的测定截止波长均在200 nm附近, 故本实验选择254 nm作为检测波长. 在反相色谱中, 常用的流动相是甲醇(MeOH)、乙腈(CH3CN)和四氢呋喃(THF)等有机溶剂与水的混合物, 有机相是强溶剂, 水是弱溶剂, 改变有机相和水的比例, 可调整流动相的强度. 本实验中样品为木芙蓉的提取物成分复杂，如果仅用甲醇—水或乙腈—水二元溶剂无法将芸香苷与其他成分分离开. 考虑到芸香苷分子中酚羟基易产生电离, 在固定相表面有双重保留机制的缘故而使峰有严重的拖尾[7], 在流动相中加入1%的醋酸可使酚的电离得到抑制, 成为在反相条件下疏水缔合物型的中性分子, 分离效果和峰形都可得到较大的改善. 本实验当选择甲醇—1%醋酸溶液(/)为50: 50, 流动相流速1 mL/min时芸香苷出峰时间短, 与其他成分的分离效果良好.

2.2.2 精密度试验

取芸香苷标准溶液高、中、低三个浓度(8.32 mg/L, 24.96mg/L, 41.6mg/L), 分别在日内不同时间(0, 1, 3, 6h)进行HPLC测定, 分析结果如表8.从表8所显示的数据, 可以知道样品的测定在日内有较好的精密度.

表2 精密度试验数据及处理结果

2.2.3 回收率试验

表3 第1次回收率试验数据及结果处理

表4 第2次回收率试验数据及结果处理

表5 第3次回收率试验数据及结果处理

3 结论

从木芙蓉叶中可提取芸香苷, 索氏提取法的提取率高于超声波提取法, 含量在0.2%左右. 索氏提取法的最佳条件：60%甲醇水溶液作溶剂, 料剂比为1: 15, 萃取温度为65～70 ℃, 萃取时间为2.5 h. 采用高效液相色谱外标法可测定木芙蓉叶中芸香苷含量. 分离测定样品采用十八烷基柱(3.9×150 mm, 4 µm), 流动相为甲醇—1%醋酸(50/50,/), 流速为1mL/min, 紫外检测器的检测波长为254 nm. 芸香苷在4.16～41.6 mg/L范围内线性良好(= 0.999 3). 日内相对标准偏差(RSD)在5.32%～6.02%范围内, 高、中、低浓度回收率平均值为98%.

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[3] 李培凡, 张韵慧, 肖莉, 等. RP—HPLC法测定不同产地槐米中芦丁[J]. 中草药, 2006, 37(9): 1419-1420.

[4] Kazuo Ishii, Takashi Furuta, Yasuji kasuya. Determinat- ion of rutin in human plasma by HPLC.utilizing solidph- ase extraction and ultraviolet[J]. J Chormatogr B, 2001, 759: 161.

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Content determination of Rutin in hibiscus mutabilis by HPLC

CHEN Zhen-gan, TANG-Xiao-mei, CHEN Yuan-dao, ZHOU Shi-biao

(College of Chemistry & Chemical Engineering, Hunan University of Arts and Science, Changde 415000, China)

To establish a method for content determinate of Rutin in Hibiscus mutabilis by HPLC. The chromatograp- hic column was C18 column(3.9×150 mm, 4 um), methanol and 1% acetic acid solution (50/50,/) as mobile phase, at a flow rate of 1.0 mL/min, detection wavelength 254nm.Good linearity was obtained for Rutin and other components in the range of 4.16 ~ 41.6 mg/L peak area was favorable linear between the concentration of Rutin in range. The regression equation was=15 086*C-26 310, correlation coefficient= 0.999 3, The RSD of intra-day assay is within 5.32% ~ 6.02%.

HPLC; hibiscus mutabilis; rutin

O 657.7+2

A

1672-6146(2010)03-0053-04

10.3969/j.issn.1672-6146.2010.03.014

2010-07-20

湖南省教育科学“十一五”规划课题(XJK08BJG006)

陈贞干 (1957-), 男, 高级实验师, 主要研究方向为有机分析.