PEG胁迫对尖叶胡枝子幼苗SOD和POD同工酶的影响

马彦军,曹致中,李 毅

(1.甘肃农业大学草业学院,甘肃兰州 730070;2.甘肃农业大学林学院,甘肃兰州 730070)

尖叶胡枝子(Lespedeza hedysaroides)为草本状半灌木,具有防风固沙,抗寒、耐旱、耐贫瘠等特性,是较好的水土保持植物,又因其适口性好[1-3],粗蛋白质和粗脂肪含量高,返青早、枯黄晚、绿期长等优点[4],可作为改良干旱、半干旱退化草地和建植人工草地的优良牧草,被广泛应用于我国草地生态建设和城乡绿化美化中[5,6]。水分胁迫是植物生长发育过程中最易遭受到的生态胁迫因子[7],它对植物形态、光合作用、呼吸作用、物质运输与合成等均会产生深刻的影响[8]。同时,植物也会通过一些生理生化反应来适应水分胁迫生境,如适度干旱胁迫时,植物体内有关代谢酶活性升高,细胞膜系统的抗氧化能力增加,可以消除植物体内的过氧化氢(H2O2)和超氧阴离子自由基(O2-)等活性氧对细胞膜系统的损伤,从而提高植物的抗逆性[9]。目前,对胡枝子属植物的栽培及生态生物学的研究报道较多[10],而其抗旱性研究报道较少[11-13]。为此,以尖叶胡枝子幼苗为对象,研究PEG模拟干旱胁迫对其幼苗超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化物酶(POD)同工酶、酶含量以及酶活性的影响,初步揭示其抗旱机理,了尖叶胡枝子抗旱性研究,合理开发利用及育种提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

供试材料为2006年在平凉灵台收集的尖叶胡枝子种子。

1.1.1 种子预处理 将供试种子用75%的酒精消毒1～2 min后,用无菌水冲洗干净,在100℃水中浸泡5 min后,用自来水冲洗冷却降温,放置24 h后剔除未吸胀种子,备用。

1.1.2 PEG处理 将经过预处理的种子置于120 mm培养皿内浸透了不同浓度PEG(质量浓度分别为50 g/L,100 g/L和150g/L)溶液的滤纸上发芽,每天向滤纸加PEG溶液数滴,以浸透滤纸并稍有剩余,每2 d换1次滤纸,以尽量减少水势变动。对照(CK)以蒸馏水代替PEG。每个浓度梯度(包括对照)3次重复,每个重复100粒种子。室温下发芽,待苗高达到5 cm时,取叶片进行SOD和POD同工酶电泳。

1.2 试验方法

1.2.1 粗酶液的制备 分别称取不同PEG浓度处理的尖叶胡枝子叶片0.5 g,加入2 mL 50 mmol/L pH 7.8的磷酸缓冲液(PBS内含2 mmol/L EDTA-Na2,1%聚乙烯吡咯烷酮)冰浴研磨成匀浆,匀浆于13 000 rpm,4℃离心20 min,上清液即为粗酶提取液。

1.2.2 电泳 采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳。分离胶浓度7%(以丙烯酰胺浓度计),浓缩胶浓度为3%(以丙烯酰胺浓度计),点样量20μ L,在 80～100 V 稳压条件下电泳3～4 h。

POD染色采用联苯胺染色法。待酶带显出,立即放入自来水冲洗,酶带全变成棕色,在GDS-8000凝胶成像系统上拍照;

SOD染色采用氮蓝四唑(NBT)法。用4000×光照25～30 min SOD的活性谱带表现为蓝色背景上的无色透明区带,在GDS-8000凝胶成像系统上拍照。

结果采用国际认证的Pharmacia Biotech公司的电泳图谱分析软件ImageMaster 1D(Version 2.0)进行谱带分析。

SOD和POD活性单位采用GDS-8000凝胶成像系统扫描的灰度值表示。

2 结果与分析

2.1 不同浓度PEG胁迫对尖叶胡枝子幼苗叶片SOD和POD同工酶的影响

结果显示(表1),尖叶胡枝子幼苗叶片在不同浓度PEG胁迫,SOD和POD同工酶谱带数目没有变化,无新酶带的出现或酶带的减少,分别为酶带SOD1-4和POD1-3。

表1 PEG胁迫尖叶胡枝子幼苗叶片S OD和POD同工酶迁移率Table 1 Mobility rate of S OD and POD isozyme in the seedling of Lespedeza hedysaroides

由表1可以看出,不同浓度PEG处理,尖叶胡枝子幼苗叶片4种SOD同工酶的迁移率大小不一。SOD1和SOD2在100 g/L和150 g/L PEG处理下迁移率一致,分别为0.04和0.44,在50 g/L PEG处理下分别为0.05和0.43,对照分别为0.03和 0.42;SOD3在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG处理下,迁移率一致为0.62,对照为0.61;SOD4在100 g/L和150 g/L PEG处理下迁移率一致,为0.94。在50 g/L PEG处理下和对照的迁移率一致,为0.93。在对照和50 g/L PEG处理下,各同工酶的迁移率不一致,而在100 g/L和150 g/L处理下,各SOD同工酶的迁移率一致。

不同浓度PEG处理,尖叶胡枝子幼苗叶片3种POD同工酶的迁移率大小不一。POD1在50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG处理下迁移率均为0.01,对照为0.02;POD2在对照、50 g/L,100 g/L和150 g/L PEG 处理,迁移率分别 0.11、0.12、0.10和 0.11;POD3对照和各处理下迁移率一致均为0.050(表1)。迁移率的不同,说明SOD和POD同工酶分子量大小不同。由迁移率可以看出,尖叶胡枝子幼苗叶片在不同浓度PEG处理下,共有10种SOD同工酶基和6种POD同工酶基因表达。

2.2 不同浓度PEG胁迫对尖叶胡枝子幼苗叶片SOD和POD同工酶酶量及活性的影响

SOD和POD是细胞抵御活性氧伤害的膜保护系统,在清除超氧自由基、过氧化氢和过氧化物及阻止或减少羟基自由基形成方面起重要作用。在水分胁迫下,植物细胞自由基产生和清除的平衡遭到破坏,过剩的自由基会伤害细胞膜系统,因此,SOD、POD的活性与植物的耐旱能力密切相关,其高低可以反映植物对干旱逆境抵御能力的大小。尖叶胡枝子幼苗叶片在50和100 g/L PEG浓度处理以及对照下,SOD和POD同工酶及总酶酶量逐渐在增加,其中,POD3在0～50 g/L PEG处理下,酶量下降,50～100 g/L PEG处理下,酶量增加。100～150 g/L SOD和POD同工酶及总酶量逐渐在降低(图1)。随着PEG胁迫程度的加深,尖叶胡枝子幼苗叶片SOD和POD活性均呈现先增大后减少的趋势。低胁迫水平使SOD和POD活性增加,高胁迫水平使SOD和POD活性降低。酶量和酶活性之间呈正相关,酶量增加酶活性增大,酶量减少,酶活性下降。

图1 PEG处理下尖叶胡枝子幼苗叶片SOD(左)和 POD(右)同工酶酶量的变化Fig.1 Effect of PEG on S OD and POD isozyme concentration in the seedling of Lespedeza hedysaroides

图2 PEG处理下尖叶胡枝子幼苗叶片 S OD(左)和POD(右)同工酶酶活性的变化Fig.2 Effect of PEG on S OD and POD isozyme activity in the seedling of Lespedeza hedysaroides

3 结论与讨论

SOD,CAT和POD是生物体内的保护性酶,在清除生物自由基上担负着重要功能,SOD能将O2-转化为H2O2,而CAT和POD可将H2O2进一步清除产生H2O,三者协同作用可使自由基维持在一个较低水平,从而避免膜伤害,达到保护细胞的目的。王娟等[14]报道,植物在水分胁迫初期SOD,CAT和POD活性升高,但随着水分胁迫时间延长和强度增加,SOD,CAT及POD活性则不同程度下降,与此次实验结果一致。实验表明,PEG浓度在50～100 g/L时,SOD和POD酶活性增加,PEG浓度为150 g/L,SOD和POD酶活性下降。说明适度水分胁迫能增强植物对干旱的适应性,同时这两种酶活性的协调变化,也显示了植物生理过程变化的协调性。

研究表明,同工酶与作物抗旱性有一定的联系[15],尖叶胡枝子幼苗水分胁迫后,叶片SOD、POD同工酶未出现新的酶带,但酶谱迁移率大小不同,说明在不同胁迫下出现了不同酶的基因表达。共有10种SOD同工酶和6种POD同工酶基因表达。

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