RASSF1A、CK19和p53在甲状腺良恶性病变中的表达及临床意义

徐美荣 许建成 陈 云 周绍荣 池鸣鸣

甲状腺肿瘤是较常见的内分泌腺肿瘤，在总人群中的发病率为4% ～7%，其中大多数为良性，恶性占肿瘤的5%，甲状腺癌在所有恶性肿瘤中的死亡率约占1%;其中甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的1种类型;由于甲状腺肿瘤多起病隐匿、进展缓慢，一般良恶性肿瘤的症状和体征亦无明显的区别，极易误诊，而且恶性肿瘤的恶性程度高低不一，治疗方法也大不相同。虽然术前B超和细针穿刺细胞学检查(FNAB)已广泛用于术前诊断，但这种方法仍有很大的局限性，大约有15%～20%的细针穿刺组织在细胞形态上处于交界状态，这时良恶性则难以鉴别;对于这类患者，因为缺乏明确的术前诊断和预后判断标准，所以难以确定肿瘤的具体分级及手术切除范围，因此，寻找能够帮助诊断和鉴别诊断甲状腺乳头状癌的分子标志物是十分必要的。

1 材料与方法

1.1 材料

随机收集南通大学附属医院、上海长海医院和上海宝山区中心医院、2007年3月～2008年10月手术切除的甲状腺肿块送病理冷冻切片组织103份，所有病例术前未经任何化疗和抗肿瘤治疗。男性19例，女性84例，年龄14～70岁，中位年龄43岁。根据2004年WHO甲状腺肿瘤病理分类［1］:甲状腺乳头状癌41例，结节性甲状腺肿(结甲)19例，甲状腺腺瘤35例和桥本氏病5例。同时将恶性病例按年龄、性别等分类。组织标本经液氮速冻后，于－80℃超低温冰箱保存、备用。

1.2 方法

提取组织中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo(DT)引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再引入基因引物或内参基因引物在DNA聚合酶(Taq酶)作用下以cDNA为模板进行PCR扩增，对扩增的目的片段进行凝胶电泳，在紫外光凝胶成像系统扫描并记录。用凝胶图像分析仪对图像进行扫描，用四星图像处理系统，测定各组cDNA的特异性RNA表达量与内参之间的比值代表mRNA丰度。

引物的设计，扩增目的基因片段 RASSF1A［2］，CK19［3］，p53［4］和内参 β-actin［5］的引物由 Primers 5.0软件设计，由上海英骏生物技术工程有限公司合成。

试剂:逆转录试剂盒 K1622(Fermentas公司)，Premix Taq DRR003A(TaKaRa公司)，DNA Maker DL-2000 D501A(TaKaRa公司)。

1.3 统计方法

应用Stata7.0统计软件，定性检测阳性表达率的比较采用费歇尔精确检验(Fisher’s exact test);RASSF1A、CK19和p53相对表达量数据以±s表示，各组均数间比较采用单因素方差分析，相关性检验采用Pearson定性相关;P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RASSF1AmRNA在各组织中表达情况

RASSF1AmRNA在甲状腺乳头状癌中的阳性表达率为24.39%(10/41)，在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病中其阳性表达率分别为68.42%(13/19)、77.14%(27/35)和80.00%(4/5)(表 1)，甲状腺乳头状癌与滤泡源性良性病变组织相比，其表达缺失率差异有显著性(P＜0.05)，而3组良性病变间比较，差异无统计学意义(P＞0.05)。

半定量RT-PCR显示，RASSF1A在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病组织中的相对表达量分别为 0.1789 ±0.0112、0.6437 ±0.0827、0.6563 ±0.0855、0.5243 ±0.1345。甲状腺乳头状癌中其表达量与良性病变比较有显著差异(P＜0.01)(表2，图1)。

表1 RASSF1A mRNA在甲状腺良恶性组织中的表达(例)

表2 RASSF1A mRNA在甲状腺良恶性组织中的半定量表达±s)

表2 RASSF1A mRNA在甲状腺良恶性组织中的半定量表达±s)

注:两两比较采用Scheffe法;①为a与b比较，②为a与c比较，③为b与c比较，④为a与d比较，⑤为b与d比较，⑥为c与d比较

组别 mRNA丰度 均数差 P值结节性甲状腺瘤(a) 0.6437 ±0.0827 0.0126① 0.983①甲状腺腺瘤(b) 0.6563 ±0.0855 0.1194② 0.135②桥本氏病(c) 0.5243 ±0.1345 0.1320③ 0.055③乳头状癌(d) 0.1789 ±0.0112 0.4648④ 0.000④0.4774⑤ 0.000⑤0.3454⑥ 0.000⑥

图1 不同组织中RASSF1AmRNA表达情况

2.2 CK19mRNA在各组织中表达情况

CK19mRNA在甲状腺乳头状癌中阳性表达率为82.61%(19/23)，在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病中阳性表达率分别为 37.50%(6/16)、17.24%(5/29)、20.00%(1/5)。甲状腺乳头状癌与滤泡源性良性病变组织相比，表达缺失率差异有显著性(P＜0.05)，而3组良性病变间比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)(表 3)。

半定量RT-PCR显示，CK19mRNA在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病组织中的相对表达量分别为1.1465 ± 0.1835，0.5529 ±0.0517，0.4219 ±0.0416，0.4837。甲状腺乳头状癌中CK19mRNA表达量与良性病变组织比较有显著性差异(P ＜0.01)(图2)。

表3 CK19mRNA在甲状腺肿块组织中的表达情况(例)

图2 不同病变组织中CK19表达

2.3 p53mRNA在各组织中表达情况

p53mRNA在甲状腺乳头状癌中阳性表达率为41.46%(17/41)，在结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病中阳性表达率分别为 15.79%(3/19)、5.71%(2/35)、0(0/5);甲状腺乳头状癌与滤泡源性良性病变组织比较，其表达缺失率差异有显著性(P＜0.05)，而3组良性病变组织间比较，差异无统计学意义(P ＞0.05)(表 4)。

半定量RT-PCR显示，p53mRNA在甲状腺乳头状癌、结节性甲状腺肿、甲状腺腺瘤和桥本氏病组织中的相对表达量分别为 0.8024 ±0.1940，1.5393 ±0.2066，1.3913 ± 0.2152，1.5511 ± 0.2485，甲状腺乳头状癌中其表达量与良性病变组织比较有显著性差异(P ＜0.01)(图 3)。

2.4 RASSF1A表达与CK19和p53表达的相关性

100例甲状腺良恶性病变中，RASSF1A表达阳性，同时CK19表达阴性为36例;RASSF1A表达阴性，同时CK19表达阳性为30例，两者表达呈负相关(Pearson 点相关系数为 －0.3181，P=0.0013);RASSF1A 表达阳性，同时p53表达阳性为7例;RASSF1A表达阴性，同时p53表达阴性为31例，两者表达呈正相关(Pearson 点相关系数为 0.2364，P=0.0179)(表 5)。提示RASSF1A、CK19和p53在甲状腺乳头状癌的发生中具有协同作用，联合检测更有利于甲状腺乳头状癌的诊断和鉴别诊断。

表4 p53mRNA在甲状腺肿块组织中的表达情况(例)

图3 不同病变组织中p53mRNA表达

表5 RASSF1A表达与CK19和p53表达的相关性(例)

3 讨论

甲状腺癌主要由滤泡源性癌和C细胞源性的髓样癌组成，前者有乳头状癌、滤泡状癌和未分化癌，其中甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的1种类型。国际上公认的甲状腺乳头状癌的病理诊断标准为:由含有纤维血管轴心的乳头和由瘤细胞构成的滤泡结构组成，瘤细胞的细胞核大，染色质淡染，呈毛玻璃样，核仁不明显，核膜增厚，核重叠，有时可见核沟及核内包涵体，间质中常伴有沙砾体形成［6］，但恶性肿瘤具有异质性，有些甲状腺乳头状癌并不具有上述特征，有些甲状腺良性乳头状增生性病变也具有毛玻璃核。一些甲状腺乳头状癌单凭HE染色难以与其他甲状腺病变区别，因此寻找能帮助诊断和鉴别诊断甲状腺乳头状癌的特异性标志物很有必要。

2000年，Dammann等［7］采用酵母双杂交筛选方法，首次在染色体3p21.3内120 kb长的最小纯合缺失区克隆出1种能与DNA修复蛋白XPA相互作用的基因，即RASSF1基因，主要有A、B、C 3种转录本，其中RASSF1A含1α、2αβ和外显子3～6，其cDNA全长为1873 bp，编码1个分子量为38.8 kD含有340个氨基酸的蛋白多肽。本研究通过检测RASSF1A mRNA在甲状腺乳头状癌和滤泡源性良性病变中的表达情况，结果显示，23例甲状腺乳头状癌中仅6例表达阳性，阳性率 26.09%，结甲、腺瘤和桥本氏病的RASSF1A阳性表达率分别为 68.75%(11/16)、75.86%(22/29)和 80.00%(4/5)，甲状腺乳头状癌阳性表达率与滤泡源性良性病变比较有显著差异;且半定量结果显示，在甲状腺乳头状癌中的表达量明显下降，但甲状腺乳头状癌中RASSF1AmRNA的表达缺失率与患者年龄、性别、肿瘤大小和浸润转移均无明显的相关性，提示RASSF1A基因可能是甲状腺乳头状癌重要相关抑癌基因，参与了甲状腺乳头状癌的发生发展。

Cytokeratin 19是1个低分子量的角蛋白，是角蛋白家族中最小的酸性蛋白质，属于中微丝(Intermediate ferdament)蛋白家族，是上皮细胞骨架的一部分。国内外研究认为CK19的过度表达与肺癌、乳腺癌的发生发展有关［8，9］。最近，Tedgui等［10］利用组织芯片和免疫组化技术研究发现，CK19在80.9% 的甲状腺乳头状癌中弥漫强表达，是诊断甲状腺乳头状癌的有用标记。

人类p53基因定位于17号染色体短臂1区3.1带(17P13.1)，全长 16～20 kb，基因组有 11个外显子，10个内含子。p53基因具有进化保守性，可在DNA复制水平上调节细胞的正常生长，是细胞生长的重要的调节因子。

本实验通过定性相关性统计发现，100例甲状腺良恶性病变中，RASSF1A表达阳性，同时CK19表达阴性36例;RASSF1A表达阴性，同时CK19表达阳性为30例，两者表达呈负相关。RASSF1A表达阳性，同时p53表达阳性为7例;RASSF1A表达阴性，同时p53表达阴性为31例，两者表达呈正相关。提示RASSF1A、CK19和p53在甲状腺乳头状癌的发生中具有协同作用，联合检测更有利于甲状腺乳头状癌的诊断和鉴别诊断。

目前，甲状腺癌的误诊和漏诊临床上不少见，致使部分甲状腺良性肿瘤患者接受了不必要的过大手术，增加了一些不必要的经济费用，而部分甲状腺恶性肿瘤患者常因手术范围不够而需接受2次手术。因此寻找能够帮助诊断和鉴别诊断甲状腺乳头状癌的分子标志物十分必要。本研究结果提示，RASSF1A、CK19和p53的检测可作为良恶性甲状腺滤泡源性肿瘤鉴别诊断的指标之一，联合检测结果更可靠。

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