电针对大鼠脊髓损伤后 Slit2表达的影响*

尹明锡 宋金铃 时素华 宋 萌 耿 直 郑光华 李志刚 北京中医药大学(北京 100029)

脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)指因直接暴力或间接暴力作用在正常脊柱和脊髓组织,致损伤平面以下脊髓各项功能,包括运动、感觉、括约肌和反射功能障碍 ,是人类致残率最高的疾患之一,损伤修复也是神经科学领域内一道尚未解决的难题。督脉电针治疗 SCI有较好的临床疗效已得到医学界广泛的认可,但其具体作用机制尚不完全清楚。督脉电针是电针中最常用的一种 ,治瘫首取督脉[1-2]。本实验通过 RT-PCR研究SCI后 Slit2 mRN A的表达 ,探讨针刺治疗 SCI作用机制 ,旨在为临床针灸治疗脊髓损伤后提供实验依据。

1 材料与方法 1.1实验动物及分组 雄性健康 SD大鼠 72只,体重 240±20g,由北京维通利华动物中心提供。随机分为空白组,模型组,电针组,药物组。每组各 18只,每组再随机分为三个时间组,6h、1d和 7d组。

1.2 针具 针灸针用华佗牌无菌针灸针,规格:0.30×13mm。电针用韩氏(HAN S)电针仪,型号 LH-202H。

1.3 脊髓损伤动物模型制作 用 10%水合氯醛(3.5mL/kg)腹腔麻醉,固定于自制的弓形手术台上。按肋骨确定椎体序列,大鼠背部最下端肋骨缘横对 T13为标志,向上依次定位 T9-T11。背部脱毛剂脱毛;分离背部肌肉,沿深筋膜肌肉附着点剪开深筋膜,暴露棘突和椎旁肌肉;用刀片自棘突向两侧顺次剥离椎旁软组织,暴露 T9-T11段棘突和椎板;用组织钳咬住 T10棘突轻轻上提,显露 Tl0T11椎间隙,弯眼科剪剪除T10椎板及其上关节突和下关节突,暴露脊髓;参照经典的改良式的 Allen’s打击方法,用自制的打击器打击 T10段脊髓5cmx10g,立即移去打击器,模型成功标准是:鼠尾持续剧烈摆动数秒,双下肢及背部肌肉瞬时收缩,硬脊膜下出血,麻醉醒后双下肢表现为不完全瘫痪。

1.4 治疗 电针组于造模后大约半小时即大鼠苏醒后先行 CBS评分,再选取“大椎”(DU14;第 7颈椎棘突下,向下斜刺 )、“命门”(DU4;第 2腰椎棘突下,向上斜刺)进行针刺治疗,进针约 0.5-0.7cm。使用韩氏 LH-202H型穴位神经刺激仪,大椎穴接阴极 ,命门穴接阳极,持续脉冲电流,频率 2Hz,治疗时间 20min,输出强度在刚开始时以背部肌肉出现轻微抽动为度,待其适应后则以双下肢瘫痪肌肉出现有节律的收缩为度。电针组每天同一时间重复治疗一次。

药物组于造模后以 30mg/kg体重的甲基强的松龙尾静脉注射。药物组于第二天同一时间以 5.4 mg/kg体重的甲基强的松龙尾静脉重复注射一次,之后再不给药。

空白组和病理组不做任何治疗,但要在同一时间均抓取一次,以保证应激条件相同。

1.5 动物取材 造模后 6h、1d、7d取空白组、模型组、电针组及药物组大鼠各 6只,动物处死后,迅速置于冰盘上取脊髓损伤区 1cm约 50mg的脊髓组织,置于匀浆器中,加入 Trizol试剂 lmL匀浆,冰上作用 l0min。

1.6 指标的检测 总 RN A抽提试剂盒 Trizol购自Invitrogen(GIBCO公司 ,USA),USA)。 Slit2、Nogo-A特异性引物由北京奥科生物技术有限责任公司合成(采用 Primer5.0引物设计软件)Slit2上、下游引物序列分别为 5CTTgCCCAT CAATgCCTTCTCCTA-3和5 gCAgCCgCACTTCACCACT T TCTC-3,扩增产物长度 410bp;β-action为内参照,上、下游引物5 rGCTGAGTATGTCGTGGAGTC-3和5 GATGCAGG GATGATGTTC-3,扩增产物长度 356bp。参照 GIBCO公司RN A抽提试剂盒说明提取总 RN A,紫外分光光度计测定总RN A含量,-70℃保存。取总 RNA2uL,按照 PCR反应试剂盒操作进行 ,RT反应:采用 20μL反应体系,Total RN A2 μL,Oligo(dt)primer 1 μL,H2O14.5ul,M Buffer 5.0 μL,dN TPS 1.0μL,RNase Inhibitor0.5 μL,M-MLV(反转录酶 )1.0μL,轻度离心 3～ 5s,反应条件为 42℃60min,95℃5min,4℃保温或 -20℃保存备用。 PCR反应条件:95℃预变性 5min,然后 94℃、56℃、72℃分别 30 S,30循环,最后 72℃延伸 8 min。 琼脂糖凝胶电泳观察 PCR产物,使用凝胶图像分析软件 Bandscan4.5测定实验组 Slit2条带和内参β-actin的灰度值,以两者的比值表示 RT-PCR实验组产物的相对含量,进行定量分析。

1.7 统计学分析 统计分析采用 SAS软件进行。所得数据以均数±标准差(±s)表示。组间比较采用方差分析。以P＜0.05作为统计学差异显著性的标准。

2 结 果 图像中空白组、模型组、电针组、药物组 6h、1d、7d的 RT-PCR检测结果各得到一条 410bp(Slit2)的扩增产物 (图 1～ 3)。

2.1 根据结果分析统计 造模后 6h:①与空白组比较,模型组大鼠脊髓组织中 Slit2 mRNA基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05);②与模型组比较,药物组和电针组的 Slit2 mRN A基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05)。③药物组和电针组 Slit2mRNA基因表达互相比较,电针组略高于药物组,无显著性差异(P＞0.05)。

造模后 1d:①与空白组比较,模型组大鼠脊髓组织中 Slit2 mRN A基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05);②与模型组比较,药物组和电针组的 Slit2 mRNA基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05)。③药物组和电针组 Slit2 mRN A基因表达互相比较,电针组略高于药物组,无显著性差异 (P＞0.05)。

造模后 7d:①与空白组比较,模型组大鼠脊髓组织中 Slit2 mRN A基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05);②与模型组比较,药物组和电针组的 Slit2 mRNA基因表达升高,有显著性差异(P＜0.05)。③药物组和电针组 Slit2mRN A基因表达互相比较,电针组略高于药物组,无显著性差异 (P＞0.05)。

表1 脊髓组织中 Slit-2基因表达图像分析结果(±SD)

表1 脊髓组织中 Slit-2基因表达图像分析结果(±SD)

注:与模型组比较△ P＜0.05。

组 别 n 6h n 1d n 7d模型 组 6 0.410± 0.049 6 0.503± 0.031 6 0.617± 0.10空白 组 6 0.288±0.063△ 6 0.225±0.061 6 0.217±0.022△电针组 6 0.616±0.031△ 6 0.714± 0.102△ 6 0.813±0.114△药物组 6 0.580±0.134△ 6 0.694± 0.112△ 6 0.745±0.059△

2.2 脊髓 Slit-2基因表达图

图中最左边泳道为 maker,2～ 7泳道为 1d模型组,8～ 13泳道为 1d空白组,14～ 19泳道为 1d药物组,20～ 25泳道为 1d电针组。从图中可以看出,模型组条带颜色较暗,表示其表达较少;电针组和药物组条带颜色较亮,表示其表达较多。

3 讨 论 SCI属中医“截瘫”、“痿癖”范畴。中医学认为脊髓损伤虽在脊柱,主要损及督脉。督脉总督周身之阳经,有统摄元阳、振奋全身阳经的功能,且督脉与任、冲、阳维脉皆有联系,可调节全身气血,在全身经络系统中处于主导地位,与现代医学所描述的脊髓作为中枢神经的功能相类似。因此一旦损伤,则气血瘀滞,累及手足三阳经,导致经气不利、经络不通 ,或者出现肢体麻木 ,不能活动,甚至因阳经久病而损及阴经,最终出现阴阳俱虚。总之,中医学认为脊髓损伤后所产生的各种症状,乃因瘀阻督脉,枢机统帅失职 ,三阳经气血逆乱而致。其病因为“瘀血”,病机为“督脉枢机不利”。因此在治疗上应该疏通督脉以壮一身之阳气,而气能行血,气壮则血活,血活则瘀去,瘀去则气机调畅、络活经通。督脉电针调节督脉经气、疏通气血,还是一种脉冲电场,具有针刺和电场双重作用。大量临床实践及实验证明[3-5],电针能促进 SCI后神经功能的恢复。

Slit是近年来发现的重要神经生长导向因子[6]。分子质量170～ 190KD,它以浓度梯度指导生长锥靶向生长[7],通过排斥性轴突导向,促进轴突分支,并且在神经发育过程中通过排斥作用引导神经前体细胞迁移[8,9]。Slits的主要功能为:对轴突生长的排斥性导向作用;引导神经细胞运动的导向作用;促进背根神经节轴突的延伸和分枝;抑制化学趋向因子诱导的白细胞运动[10]。

哺乳动物中现已发现 3种亚型:Slit1,Slit2,Slit3[11,12],其中在指导脊髓抻经投射方面。Slit2起主导作用[13]。 Tessier-Lavigne实验室证明 Slit2可排斥某些运动神经元的轴突,还可促进感觉神经元轴突的延伸。通过原位杂交观察到 Slit2 mRN A表达在发育期脊髓神经管的腹侧、背侧中线结构以及运动神经元前体区域。Slit2作为关键蛋白指导神经纤维的生长方向发挥重要作用[14]。

我们在实验中观察到,在正常成年大鼠(空白组)脊髓前角运动细胞中,slit2 mRN A表达较低 ,脊髓损伤后的 6h、1d和 7d slit2mRN A表达显著升高,炎性细胞开始在损伤周围浸润.此时损伤位点上方前角运动神经元中 slit2 mRN A的表达明显增加,而电针组和药物组 6h、1d和 7d slit2 mRN A表达明显升高程度大于模型组。这提示,电针治疗对大鼠脊髓损伤后 Slit-2 mRN A表达具有明显的促进作用,可能对轴突的正确导向性生长发挥重要作用。

诸多神经营养因子如 NGF,N T-3,bFGF,BDN F,GDNF等在 SCI后均有表达,但再生轴突都很短且往往不能和损伤远端建立正确的联系,而 Slit作为一种大分子蛋白质,其结构的复杂性本身就已说明它在引导神经生长方面的重要地位,本实验观察到督脉电针能促进大鼠脊髓损伤后 Slit2大量表达。督脉电针可能是通过提高 SCI后脊髓 Slit的表达,引导再生的轴突穿越脊髓损伤区并沿着正确的路径投射到靶目标,实现和下位靶器官的精确联系,从而促进 SCI后的修复。

SCI后的再生修复是一个非常复杂的过程,脊髓损伤的实验与临床研究已取得了新的进展,治疗效果不断提高。但电针刺激通过什么样的信息传导通路对 Slit2表达进行调控,以及电针治疗 SCI,均有待于学者们进一步深入探索。

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