何首乌饮对衰老雄性大鼠睾丸生殖功能的影响*

郭凯华，高福禄，牛嗣云，陈 龙

（承德医学院，河北承德 067000）

随着衰老，睾丸的结构和功能会出现不同程度的减退，精子生成能力减弱、血清睾酮水平降低[1-2]。睾酮可促进睾丸生精功能，维持性腺的正常结构与功能；睾丸局部调节因子IGF-1对精子发生也具有调节作用。何首乌饮由《宣明论方》何首乌丸加味而成，具有补肝肾、益精血、延年益寿之功效。本研究给予衰老模型大鼠何首乌饮灌胃，探讨其对衰老雄性大鼠生殖功能的影响。

1 材料与方法

1.1 药品与试剂 D-半乳糖，北京化学试剂公司；放射免疫试剂盒，北京北方生物技术研究所；IGF-1 mRNA原位杂交试剂盒，天津灏洋生物制品科技有限公司。

何首乌饮方剂组成：何首乌、肉苁蓉、怀牛膝、淫羊霍、丹参、茯苓，按质量比3:2:3:2:5:3混合，熬制后含生药为9.6g/ml，4℃保存，给药前复温至25-30℃。何首乌丸方剂组成：何首乌、肉苁蓉、怀牛膝，按质量比3:2:3混合，熬制后含生药2.06g/ml，4℃保存，给药前复温至25-30℃。

1.2 实验动物分组及建立衰老模型 8周龄清洁级SD雄性大鼠32只，由河北医科大学实验动物中心提供，体重180-220g。将大鼠随机分为正常组、模型组、何首乌饮组和何首乌丸组，每组8只大鼠。模型组、何首乌饮组和何首乌丸组大鼠均采用6%D-半乳糖（300mg/kg/d，60d）连续腹腔注射建立亚急性衰老动物模型。造模成功后，模型组大鼠不再做处理，何首乌饮组和何首乌丸组大鼠分别给予何首乌饮（38.4g/kg/d）和何首乌丸（8.24g/kg/d）灌胃60天。

1.3 检测血清睾酮浓度 各组大鼠灌胃结束后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，经内眦取血，离心取上清，采用放射免疫法检测血清睾酮浓度。

1.4 精子计数，观察精子活动度和存活率 各组大鼠取血后，取一侧附睾头放入盛有5ml生理盐水并于37℃水浴中预热的小培养皿中，剪碎成精子悬液，37℃水浴静置20min，取0.1ml滴于37℃预热的血细胞计数板上，光镜下迅速观察，记录200个精子，计算精子活动度，精子计数按红细胞计数法。取精子悬液1ml，0.4%台盼兰0.1ml染色，光镜观察，计算100个精子中活精子的比例。

1.5 睾丸IGF-1 mRNA表达的检测及定量分析 大鼠取附睾后，4%多聚甲醛灌流固定，取双侧睾丸，入含1：1000 DEPC的4%多聚甲醛中固定2h，常规石蜡包埋，Leica石蜡切片机连续切片，片厚7μm。采用原位杂交方法观察睾丸IGF-1 mRNA的表达，DAB显色，苏木素复染，常规脱水、透明，中性树胶封片。阴性对照用PBS代替一抗。IGF-1杂交探针序列：上游引物5'-GTCGTCTTCACATCTCTTCTACCTGGCACTC-3'，下游引物5'-GAGAGCCAGGTAGAAGAGATGTGAAGACGAC-3'。

采用MiVnt图像分析系统进行定量分析，每个标本检查3张切片，每张切片在10×40倍显微镜下检查10个视野，计数每个视野IGF-1 mRNA阳性细胞数和阴性细胞数，计算免疫阳性细胞数占细胞总数的百分比。

1.6 统计分析 采用SPSS 13.0统计软件进行统计处理，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用q检验。

2 结果

2.1 大鼠血清睾酮浓度 见附表。模型组大鼠血清睾酮浓度明显下降，与正常组比较差异显著（P＜0.05）；何首乌饮组大鼠血清睾酮浓度明显高于何首乌丸组和模型组（P＜0.05）。

2.2 大鼠附睾头精子计数、精子存活率和活动度 见附表。模型组大鼠精子数量、存活率和活动度均明显低于正常组（P＜0.05）；何首乌饮组大鼠精子数量、存活率和活动度明显高于何首乌丸组和模型组（P＜0.05）。

2.3 大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达 IGF-1 mRNA阳性产物位于睾丸间质细胞、支持细胞和精母细胞胞浆，呈棕黄色弥散颗粒状（附图）。定量分析结果见附表：模型组大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达明显低于正常组（P＜0.05）；何首乌饮组大鼠睾丸IGF-1 mRNA的表达明显高于何首乌丸组和模型组（P＜0.05）。

附表 大鼠各指标检测结果（±s）

附表 大鼠各指标检测结果（±s）

与正常组比较：*P＜0.05；与模型组比较：#P＜0.05；与何首乌饮组比较：▲P＜0.05

组别 精子相关指标（n=8） 睾酮IGF-1 mRNA数量（106/ml）存活率（%）活动度（%）（ng/ml，n=8） （%）正常对照组4.62±0.4790.4±4.3181.04±9.954.65±1.1612.42±0.38模型组2.60±0.46*▲46.99±4.73*▲44.8±6.21*▲0.99±0.35*▲ 2.56±0.4*▲何首乌饮组4.45±1.58#78.8±6.65#74.35±9.47#4.01±0.89# 8.99±2.34#何首乌丸组4.11±1.34#65.23±4.36#▲61.33±6.31#▲2.16±1.13*#▲ 5.92±1.01*#▲

图 大鼠睾丸IGF-1 mRNA原位杂交染色（×400）：1-正常组，2-模型组，3-何首乌丸组，4-何首乌饮组

3 讨论

D-半乳糖致衰老模型表现出与人类自然衰老相似的一系列生理生化改变，是目前延缓衰老实验研究应用最多的动物模型之一。衰老是机体正常的生理现象，随着年龄增长，睾丸呈现退行性变，影响睾酮的分泌和生殖功能。睾丸的生殖功能不仅受下丘脑-垂体-性腺轴的调节，同时也受睾丸局部调节因子的影响。

睾酮是启动和维持精子发生的重要激素，临床上常用睾酮水平判断睾丸的生精功能。睾酮主要通过与支持细胞分泌的雄激素结合蛋白结合维持它在生精小管内的高浓度，为生精细胞的分化提供适宜的内环境。Atantssova等对精子发生时减数分裂各个时期的观察显示[3]，睾酮能直接或间接促进生精细胞的发生和发育，抑制生精细胞凋亡。Chen等报道[4]，在下丘脑、垂体衰老变化的共同作用下，老年男性睾丸间质细胞功能降低，使睾酮合成和分泌能力下降，导致老年人血清睾酮水平降低。Henkel等发现[5]，附睾精子成熟和精子活动力的诱导均需有生物活性的睾酮的作用，因此精子活动力下降可能与血清睾酮水平降低有关。睾丸间质细胞、支持细胞可分泌多种因子，如EGF、IGF-1等，它们对精子发生均具有调节作用。缺乏IGF-1的小鼠睾丸间质细胞类固醇激素合成酶基因表达水平降低，导致间质细胞不能成熟[6]。免疫学研究发现，睾丸支持细胞和间质细胞存在IGF-1受体，IGF-1可刺激增强睾丸间质细胞甾体生成和支持细胞转铁蛋白的生成[6]。

传统医学认为肾中精气的盛衰决定衰老的速度，延年益寿中药均属补肾类药。何首乌丸由何首乌、肉苁蓉、怀牛膝组成，能填精补髓、乌发延年。何首乌饮于此基础上加淫羊藿补肾壮阳以强筋骨，丹参活血化瘀以通心脉，茯苓健脾利湿以宁心神，诸药相配通调心脾肝肾四脏，而以肾为主。本研究结果显示，何首乌饮可以提高衰老大鼠精子数量、活动度和存活率，提高衰老大鼠血清睾酮浓度、上调睾丸IGF-1mRNA的表达；表明何首乌饮可调节雄性大鼠睾丸分泌睾酮的功能，通过提高局部调节因子IGF-1 mRNA的表达，改善睾丸的生殖功能，从而延缓性腺衰老。

[1]Kaufman JM, Vermeulen A. The decline of androgen levels in elderly men and its clinical and therapeutic implications[J]. Endocr Rev, 2005, 26（6）:833-876.

[2]Andersson AM, Jensen TK, Juul A, et al. Secular decline in male testosterone and sex hormone binding globulin serum levels in Danish population surveys[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2007, 92 （12）:4696-4705.

[3]Atanassova N, Koeva Y, Bakalska M, et al. Loss and recovery of androgen receptor protein expression in the adult rat testis following androgen withdrawal by ethane dimethanesulfonate[J].Folia Histochem Cytobiol, 2006,44（2）:81-86.

[4]Chen H, Hardy MP, Huhtaniemi I, et al. Age-related decreased Leydig cell testosterone production in the brown Norway rat[J]. J Androl, 1994, 15（6）:551-557.

[5]Henkel R, Maass G, Schuppe HC, et al. Molecular aspects of declining sperm motility in older men[J]. Fertil Steril, 2005, 84（5）:1430-1437.

[6]Wang GM, O'Shaughnessy PJ, Chubb C, et al. Effects of insulin-like growth factor I on steroidogenic enzyme expression levels in mouse leydig cells[J]. Endocrinology,2003, 144（11）:5058-5064.