TGF-β1对绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA表达的影响*

李晓茹，李玉红，许 倩

（承德医学院，河北承德 067000）

胎盘来源的滋养细胞具有与肿瘤细胞相似的侵袭性，其侵袭力增强会导致高度恶性的绒毛膜癌。目前，大量研究证实基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是参与人滋养细胞侵入子宫内膜的主要蛋白酶，转化生长因子-β1（TGF-β1）可调节MMP-9的表达和活性。本实验以绒癌JEG-3细胞为研究对象，观察外源性TGF-β1在不同作用时间对绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA表达的影响，探讨绒癌侵袭转移的分子机制。

1 材料与方法

1.1 细胞来源 人绒癌细胞系JEG-3，由中国科学院动物研究所计划生育及生殖生物学国家重点实验室提供。

1.2 试剂 TGF-β1，PEPROTECH；胎牛血清，天津灏洋公司；DMEM，GIBCO BRL；Trizol总RNA提取试剂，博大泰克；通用型RT-PCR试剂盒，大连宝生物；引物及内参，上海生工；DNA Marker DL2000，大连宝生物。

1.3 JEG-3细胞总RNA的提取 取指数生长期细胞，常规消化，以1×105/ml的浓度接种于6孔板，培养48h后无血清培养24h以使细胞达到同步化。同步化后加入TGF-β1，应用浓度为100ng/ml，然后分别培养0h、12h、24h、48h和72h。按试剂盒说明操作提取细胞总RNA，以DEPC水溶解，测定260/280nm吸光度比值，琼脂糖凝胶电泳检测显示所提RNA是否完整。

1.4 RT-PCR法检测MMP-9 mRNA的表达 按通用型RT-PCR试剂盒说明操作。MMP-9上游引物（5’-3’）：TCG TGC CTC TGC CCA TAG G，下游引物（5’-3’）：CAC CCT TGT GCT CTT CCC TG，扩增产物462bp；β-actin上游引物（5’-3’）：AGC GGG AAA TCG TGC GTG AC，下游引物（5’-3’）：ACA TCT GCT GGA AGG TGG AC，扩增产物453bp。cDNA的合成：30℃、10min，42℃、30min，99℃、5min，5℃、5min。PCR扩增MMP-9：94℃、2min，94℃、30sec，57℃、30sec，72℃、1min，30个循环；PCR扩增β-actin：94℃、2min，94℃、30sec，58℃、30sec，72℃、1min，30个循环。产物于2%琼脂糖凝胶电泳，恒压120V，30min，UVP成像分析系统拍照观察。

1.5 数据处理及统计分析 采用Quantity One软件对图像进行灰度分析，每组实验至少重复4次。以目的基因条带与β-actin基因条带的灰度比值作为MMP-9 mRNA的相对表达水平，数据以（±s）表示，采用SPSS 11.5统计软件，组间资料比较采用方差分析。

2 结果

TGF-β1作用0h、12h、24h、48h和72h，JEG-3细胞MMP-9 mRNA的相对表达水平分别为：（0.21±0.01）、（0.26±0.01）、（0.30±0.01）、（0.45±0.01）和（0.66±0.02）；随TGF-β1作用时间的延长，绒癌JEG-3细胞MMP-9 mRNA的表达逐渐增加，差异具有显著性（P＜0.01）。图1-2。

图1 JEG-3细胞β-actin mRNA的表达

图2 JEG-3细胞MMP-9 mRNA的表达

3 讨论

基质金属蛋白酶（MMPs）是一族锌依赖性内肽酶，几乎可以降解细胞外基质（ECM）的所有成分，在肿瘤的侵袭、生长、转移等生物学行为中起着至关重要的作用[1]。TGF-β超家族是由多种具有共同生物学特性的细胞因子所组成的大家族，可影响MMPs的分泌和活性[2]。

MMPs是降解ECM最重要的酶，大量研究证实MMPs与肿瘤侵袭转移密切相关。膀胱移行癌组织中MMP-2及MMP-9 mRNA的水平明显高于正常膀胱组织，且随肿瘤分级的增高，表达逐渐增强[3]。肺癌组织中MMP-2、MMP-9 的表达水平显著高于癌旁肺组织和肺良性病变肺组织[4]。Tee等[5]利用KAⅡ/CD82抑制H1299人非小细胞癌细胞株MMP-9 mRNA的表达后，癌细胞的侵袭与转移显著降低。因此推测，MMP-9的表达与肿瘤的浸润转移密切相关，可能正是MMP-9对ECM的过度降解导致癌细胞离开原发灶向远处转移，使肿瘤细胞有更大的增殖浸润空间，加剧恶性化进展。正常表达的MMP-9基因可调控和维持正常组织功能，但在滋养细胞疾病中，各种因素导致MMP-9分泌和活性异常，使其正常调控作用消失，导致滋养细胞侵入子宫内膜的深度异常。

本实验采用浓度为100ng/ml的TGF-β1作用绒癌JEG-3细胞，分别于作用后0h、12h、24h、48h和72h收获细胞，采用RT-PCR技术检测各组细胞MMP-9 mRNA的表达，结果发现JEG-3细胞对TGF-β1有良好的反应性，且随TGF-β1作用时间的延长，MMP-9 mRNA的表达逐渐增加。有研究表明，TGF-β1对肿瘤的作用表现为双重性，在肿瘤发生的早期，TGF-β1表现为抑制效应，随着肿瘤的发展逐渐演变为正性介质。Kamakar等[6]通过体外实验发现，TGF-β1可抑制MMP-9的活性和表达，从而抑制滋养细胞的过度浸润侵袭，表明对于正常滋养细胞，TGF-β1可负向调控MMP-9的表达。但对绒癌JAR细胞系的研究发现，在一定浓度范围内，MMP-9基因的表达随着TGF-β1浓度的增加而增高[7]。本实验的研究对象为永生化肿瘤细胞系，推测此时可能TGF-β1已成为肿瘤刺激因子，原本对MMP-9分泌的抑制作用变成了促进作用，导致MMP-9大量表达，促进了绒癌细胞的侵袭和转移。MMPs与滋养细胞的侵袭转移密切相关，可能作为绒癌早期侵犯的指标，进一步的深入研究将为绒癌的积极治疗提供理论依据。

[1]Bischof P, Meisser A , Campana A. Paracrine and autocrine regulators of trophoblast invasion - a review [J ]. Placenta,2000, 21 Suppl A （14） : S55-S60.

[2]万秋红.TGF-β超家族信号传导机制研究进展[J].国外医学分子生物学分册，2000，22（3）：137-142.

[3]杨锦建，张秋红，贾占奎，等.基质金属蛋白酶（MMP）9、MMP2mRNA及基质金属蛋白酶抑制剂2mRNA在人膀胱移行细胞癌中的表达及意义[J].中华实验外科杂志，2006，23（4）：594-595.

[4]薛洋，周清华，张尚福，等.MMP-2、MMP-9在肺癌中的表达及其与肺癌转移和预后关系的研究[J].华西医学，2008,23（2）:225-227.

[5]Tee BK,Park KM,Surendran S,et al.KAI1/CD82 suppresses tumor invasion by MMP9 inactivation via TIMP1 up -regulation in the H1299 human lung carcinoma cell line[J]. Biochemi Biophys Res Commun, 2006,342（2）:655-661.

[6]Kamakar S,Das C. Regulation of trophoblast invasion by IL - 1beta and TGF - beta1[J]. Am J Reprod Immunol,2002,48（4）:210-219.

[7]符爱珍，蔡永广，李英勇，等.TGF-β1对人早孕细胞滋养层细胞和绒毛膜癌JAR细胞明胶酶mRNA表达的影响和意义[J].肿瘤，2007，27（9）:698-701.