优化超声提取酶解得到黄芩素的方法*

丁 翔，常金花，瞿晶田，刘翠哲

（承德医学院，河北承德 067000）

黄芩为唇形科植物黄芩（Scutellaria Baicalensis Georgi）的干燥根，具有清热燥湿，泻火解毒，止血，安胎之功效[1]。黄芩中含有黄芩苷、黄芩素等有效成分，其中黄芩苷是主要成分，黄芩素为黄芩苷的苷元。文献报道，黄芩苷为复原型前体药物，即黄芩苷口服后可以在肠内经细菌作用转化为黄芩素后被吸收，再在体内结合形成黄芩苷[2]。有关黄芩苷和黄芩素的胃肠吸收动力学研究也表明，口服黄芩苷生物利用度较低，口服黄芩素的达峰浓度以及生物利用度均高于黄芩苷[3]。

黄芩中自身存在一种酶可以将黄芩苷酶解为黄芩素，这种酶是β-葡萄糖醛酸酶，可考虑用这种酶将黄芩苷转化为黄芩素用于口服制剂中[4-5]。目前，酶解后得到黄芩素多采用浸渍法、酶解醇提法提取[6-7]；但这两种提取方法费时，且工序复杂。本研究采用酶解后超声提取黄芩素的方法，并对主要影响因素进行考察，优化了提取方法。

1 仪器与试药

1.1 主要仪器 高效液相色谱仪（日本JASCO）：UV-1575检测器，PU-1580色谱泵，ZW温度控制器，CKChrom色谱工作站；Discovery C18（250mm×4.6 mm，5μm）色谱柱；KQ100E、KQ300、KQ500B超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；TG16-WS台式高速离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；YP1200电子秤，上海精科天平公司；AG-245电子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；惠普-8453紫外可见分光光度计。

1.2 试药 黄芩的干燥根，购于中国药业集团承德有限责任公司，并经承德医学院赵春颖副研究员鉴定为统芩，产于河北承德，为热河黄芩；黄芩素对照品，批号：111595-200604，购于中国药品生物制品检定所；黄芩苷对照品，批号：715-200111，购于中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 黄芩素的分析方法

2.1.1 色谱条件[8]：Discovery C18（250mm×4.6mm，5μm）色谱柱；流动相：甲醇-水-冰醋酸（48:52:0.4）；柱温：35℃；流速：0.8ml/min；检测波长：275nm。

2.1.2 标准曲线的制备：精密称取黄芩素对照品5.23mg，置于25ml容量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即为对照品溶液。分别精密吸取对照品溶液3.0，6.0，9.0，12.0，15.0μl注入液相色谱仪，以峰面积（Y）对进样量（X）进行线性回归，回归方程为Y=4000000X-484769，r=0.9995，线性范围：0.6276-3.138μg。

2.1.3 精密度实验：分别取黄芩素对照品溶液10μl连续进样6次，记录色谱峰面积，黄芩素峰面积的RSD为1.93%。

2.1.4 供试品溶液制备：分别称取酶解后的黄芩药材600mg、黄芩素提取物250mg，加70%乙醇超声溶解，定容至100ml；精密量取10ml续滤液于100ml容量瓶中，用70%乙醇定容，即得。

2.1.5 样品测定方法：精密吸取供试品溶液各5μl，进样，测定峰面积，随行标准品，按照标准品计算黄芩素的含量。

2.2 黄芩素提取物的制备 取160.0g黄芩药材粉碎过1号筛，加6倍量水搅匀，60℃下保温10h（酶解），取出，滤过后将药材于70℃烘干（酶解后的黄芩药材），再经超声提取、干燥，即为黄芩素提取物。

选择4个对实验影响最大的因素进行正交实验。分别称取酶解后的黄芩药材9份，每份5.0g，用10倍量乙醇作为提取液[9]；选取超声功率、乙醇浓度、提取时间、提取次数4个因素进行进行考察，按照L9（34）表进行正交实验，因素和水平见表1。以从酶解后黄芩药材中提取到的黄芩素的量为指标，正交实验结果见表2，方差分析结果见表3。结果表明，因素C、D即乙醇的浓度和提取次数对从酶解后黄芩药材中提取到的黄芩素的量有非常显著的影响，提取时间和超声波功率对提取黄芩素的量有一定影响。70%乙醇和95%乙醇所得黄芩素含量接近，从成本等因素考虑，优选出提取工艺为A2B2C3D2，即超声功率300w，超声时间20分钟，超声次数4次，乙醇浓度70%。

表1 因素和水平

表2 正交实验结果

表3 方差分析结果

F1-0.01（2，∞）=4.60，F1-0.05（2，∞）=2.99，F1-0.1（2，∞）=2.3 2.3 工艺验证试验 取黄芩药材，粉碎过1号筛，称取10.0g，加入105.3ml水，将容器密闭，60℃下酶解10h，向酶解好的药材中加入95%乙醇294.7ml，配成相当于70%的乙醇溶液。用纱布过滤，滤液分成4份，按2.2确定的工艺进行提取。几份样品提取后经测定并取平均值：干燥物中黄芩素的含量为50.83%，转移率为70.43%。

2.4 工艺放大试验 取黄芩药材，粉碎过1号筛，称取1000.0g，加入10530ml水，将容器密闭，60℃下酶解10h，向酶解好的药材中加入95%乙醇29470ml，配成相当于70%的乙醇溶液。将提取液旋转蒸发，所得浸膏静置、抽滤，将滤饼干燥，得158.9g。照2.1黄芩素的分析方法制备黄芩素供试品溶液并进行测定，干燥物中黄芩素的含量为54.07%，转移率为89.77%。

3 讨论

正交实验结果表明，超声功率对实验结果影响不大，乙醇浓度对黄芩素提取率有显著影响，但从降低成本的角度考虑，选择了次佳水平，即70%的乙醇。经工艺放大试验证实该法方便有效，提取物含量达50%以上。

在进行正交实验时，酶解黄芩粉末后过滤，滤液中含有黄芩素，有文献报道不足2%，虽然可以除去水溶性杂质，但在大量生产时这种损失比较大，在对黄芩素的优化提取过程中，没有将其过滤，而采用过量的水溶解，再加入95%乙醇，配成相当于70%的乙醇溶液，这样即可以使黄芩苷酶解完全，又避免了黄芩素的损失，在提取到黄芩素的浸膏后，用水进行精制，这一步可以很好的除去水溶性杂质，避免了多次损失浪费。

[1]国家药典委员会编．中华人民共和国药典（一部）[S]．北京：化学工业出版社，2005.212.

[2]郭晓宇，杨琳，陈颖，等.黄芩素与黄芩苷大鼠体内药动学比较研究[J].中国药学杂志，2008，43（7）：524-526.

[3]刘太明，蒋学华，张梅娟，等.黄芩素与黄芩苷大鼠体内药动学比较研究[J].中国药学杂志，2006，41（23）:1784-1787.

[4]吕卫明，房喻，代珺，等.酶水解法提取分离黄芩素的研究[J].中国中药杂志，1991，16（12）:742.

[5]Yufei Zhang,HongWu,Lin Li,et al.Enzymatic conversion of Baicalin into Baicalein by β-glucuronidase encapsulated in biomimetic core-shell structured hybrid capsules[J].Journal of Molecular Catalysis B:Enzymatic,2009,57（1-4）:130-135.

[6]刘云华，黄志芳，陈燕，等.酶解法提取黄芩中黄芩素的工艺研究[J].天然产物研究与开发，2007，19（4）：688-691.

[7]王彩芳，张红岭，代桂丽，等.正交实验优选黄芩中黄芩素提取工艺[J].时珍国医国药，2007，18（10）：2509-2510.

[8]赵春颖，王汝兴.黄芩素制备工艺及含量测定方法的研究[J].承德医学院学报，2007，24（3）：239-241.

[9]姚亚红，张立伟.黄芩素提取工艺研究[J].西北药学杂志，2008，23（5）：280-282.