蔬菜雄性不育基因工程

张文英 陈绍莉

（辽宁省农业技术学校 110161）

杂种优势育种已成为许多蔬菜的主要育种方法。其中，选育雄性不育系及其恢复系是关键。通过基因工程的手段创造雄性不育系和恢复系可以克服常规育种手段的局限性，较之利用自然变异、远缘杂交和引种等选育手段具有更广阔的前景。近几年，我国在番茄、大白菜、甘蓝等蔬菜上利用基因手段获得雄性不育系方面的研究取得了较大进展。

1 基因工程雄性不育的机制

1.1 花粉发育的分子生物学研究

从植物发育分子生物学的角度来看，植物发育的各个阶段是植物基因工程时空调控表达的结果。在花粉发育过程中，减数分裂后或者小孢子有丝分裂后有大量的基因被激活，例如：番茄中的Lat 51和Lat 52等，这些花粉特异基因的启动子可以应用在雄性不育基因工程中，从而达到雄性不育和恢复可育的目的。除了花粉特异基因外，绒毡层特异表达基因也备受重视。目前，绒毡层特异的转录活动及其特异的遗传序列方面的探讨取得了初步进展，并且已经从不同植物中分离出一些绒毡层特异基因的cDNA 克隆，如番茄中的 108，127a，92b，油菜 A9 部分在花药和花粉中特异表达。

1.2 花药或花粉特异表达启动子的克隆

转基因雄性不育及其恢复的一个关键是花药或花粉特异表达启动子，花药或花粉特异表达启动子可以直接驱动人工雄性不育基因在花粉或花药内特异表达，而对雌蕊和其它器官没有影响。目前已先后分离克隆和测序了 TA29、ZM13、A9、S1、Wosg6B等花药或花粉特异表达启动子的克隆及表达时空的分析，为创造转基因雄性不育奠定了基础。

2 基因工程雄性不育的方法

2.1 借助编码细胞毒素基因的特异表达

将花粉或花药特异表达启动子、细胞毒素基因以及转录终止子3部分组装构建成嵌合基因并转化，细胞毒素的特异表达能够选择性的破坏与花粉发育相关的某些器官或组织，阻断其发育过程，导致植物雄性不育。

Mariani等把TA29与Barnase基因相连，构建了嵌合基因TA292Barnase，以农杆菌法转化到烟草和油菜，得到了转基因植株。进一步研究发现，转Barnase基因在绒毡层细胞中特异表达，专一性的破坏绒毡层的发育，导致花粉败育，而除了花粉败育外，转基因植株在其它方面都是正常的。目前，利用基因工程创造雄性不育主要采用上述方法。B lock等利用玉米的绒毡层特异启动子pca55和水稻的绒毡层特异启动子pE1和pT72与Barnase基因嵌合后转化小麦获得雄性不育植株。有人将一个编码核糖体失活蛋白 （RIP）的cDNA序列置于TA29启动子控制之下导入烟草，在21株转化株中20株表现雄性不育。我国学者在这方面也取得了很大进展。李胜国等通过融合TA29和Barnase以及TA29和Barstar构建了人工雄性不育基因和恢复基因，转化烟草后获得了雄性不育植株。Zhan等利用水稻花粉启动子psl和Barnase基因，转化在烟草中获得了雄性不育植株。凌定厚利用psl2Barnase载体获得了水稻的转基因雄性不育植株。周雪荣等将构建好的嵌合基因TA292barnase转化油菜，得到的转化株是完全雄性不育的，对花药进行组织切片分析，证明转化的barnase基因破坏了绒毡层细胞，最终导致花粉发育不良和雄性不育。钟蓉、罗玉英等和彭仁旺分别将TA292Barnase雄性不育基因导入甘蓝型油菜和烟草中，转化植株表现为雄蕊退化，花丝短于柱头，花粉萌发率极低。刘大文等利用玉米花粉启动子Zm13和Barnase基因构建了雄性不育基因，并用基因枪法转化玉米，获得了结实的转基因植株。目前，已有大量的植物花粉花药基因的特异启动子被鉴定和测序，它们与任何细胞毒素基因相连均可以培养工程不育株。不过，从目前来看，Barnase基因仍是用于培育基因工程雄性不育的最佳细胞毒素基因。

2.2 利用反义RNA技术

通过反义RNA技术阻断与花粉发育相关的基因的表达同样可以获得雄性不育株。类黄酮是花粉发育过程中的重要物质，苯基乙烯酮（CHS）是其合成的关键酶。

VanderMeer将花药盒序列与CaMV35S启动子串联，使其在花药中表达，然后将CHS基因的反义RNA基因与之串联构建成嵌合基因导入矮牵牛，实现了CHS反义RNA基因在矮牵牛花药绒毡层中的表达，抑制了CHS的合成，阻碍了花粉的发育，得到了雄性不育的矮牵牛植株。Kitashiba等将反义alter-native oxidase与TA29相连构成嵌合基因转化烟草，造成转基因烟草部分花粉败育。Schoenbeck等将反义NADH2GOGAT基因与AAT22启动子构建成嵌合基因转化到苜蓿，发现在苜蓿根瘤和花中的NADH谷氨酸合成活性下降，最终得到了雄性不育的转基因苜蓿。我国学者利用此技术成功的创造了番茄、烟草等转基因雄性不育植株。李艳红等构建了反义肌动蛋白基因和花药特异启动子TA29组成的嵌合基因，通过农杆菌介导法、基因枪法、花粉管通道法途径将该基因转化到小麦中，有60%的转化株为完全雄性不育，在烟草和番茄中也得到了类似的结果。李祥等利用TA29启动子与HSP70反义cDNA构建融合基因并转化到烟草中，创造了雄性不育植株。

2.3 提早降解胼胝质

在花粉发育过程中，小孢子的分离要靠花药绒毡层分泌胼胝质酶降解坚硬的胼胝质。这个过程有着严格的时间性，如果提前分泌胼胝质酶，过早降解胼胝质，小孢子发育就会停止，产生畸形花粉粒，导致植物雄性不育。

Worrall等将经过修饰的B21，32葡聚糖酶基因与拟南芥绒毡层特异表达的启动子A3和A9重组，使转基因植株在减数分裂时期表达过量的B21，32葡聚糖酶，从而出现了不同程度的雄性不育现象。Tsuchiya等把从大豆中分离出来的B21,32葡聚糖和从水稻中分离出来的Osg6B启动子构建成嵌合基因转化烟草，转基因植株大多数花粉缺乏萌发孔，花粉集聚，花粉粒上附着胼胝，四分体时的花粉缺乏细胞壁，从而导致在四分体开始阶段胼胝质降解，进而形成不同程度的雄性不育。

2.4 利用线粒体相关基因

在高等植物中存在的胞质雄性不育与线粒体的显性突变有关，即线粒体机能损伤会导致花粉败育。其中，RNA编辑与细胞质雄性不育有密切的关系。

Hernould等在小麦的杂合细胞质不育系中发现Atp9转录物的编辑率比可育亲本的编辑率低。这可能是RNA的非正常编辑影响ATP的合成，从而降低花粉形成所需要的ATP水平，导致雄性不育。他们利用来自小麦的非编辑的Atp9线粒体基因诱导，获得了雄性不育转基因植株。Zabaleta等通过表达Atp9的反义RNA，将由非编辑的Atp9基因诱导的雄性不育转基因植物恢复为雄性可育的植物。由于非编辑的Atp9的转录水平急剧下降，使花器官正常发育并产生种子，这也说明非编辑的Atp9基因表达可以诱导雄性不育，并可通过反义技术使其恢复育性。Hernould等在Atp9基因或其cDNA前，分别连接上酵母的输导肽编码区后，插入含CaMV35S启动子和CaMV基因工程终止子的双元表达载体中，转化烟草，在获得的转Atp9基因植株中出现半不育、全不育等类型的雄性不育株。He等将来自大豆的与细胞质雄性不育相关的线粒体DNA序列ORF239转入烟草核基因组中，转基因烟草表现为半不育或雄性不育。易平等首次证明HL型细胞质雄性不育与线粒体Atp6转录本的编辑有一定的相关性，编辑不充分的转录产物最终会干扰线粒体功能的正常发挥。

2.5 导入与细胞质雄性不育相关的基因

许多研究者发现不育与可育胞质线粒体不同。一些不育细胞质特有的质粒往往被认为与细胞质雄性不育有关，如：水稻红莲型不育系中的m3和orfH79等。把这些质粒分离出来，将其中与细胞质雄性不育有关的片段重新构建新的嵌合基因，再导入可育的植株中，可导致雄性不育。Orf224基因是在油菜Polima胞质中发现的一个与CMS相关的mtDNA基因，王永飞等已经将其克隆到pBI121载体上，构建了其植物表达载体pBRORF，欲通过农杆菌介导法和基因枪法将Orf224转入到油菜等十字花科作物的优良品种，可望获得新的CMS材料。

2.6 细菌基因在植物中组成型表达

农杆菌RhizogenesA4是植物的病原物，Schmulling等将其T2DNA间的rolc基因与CaMV35S启动子串联成嵌合基因转化烟草，由于rolc的系统表达，使得植株在形态上发生了一系列的变化，株高下降、顶端优势减弱、叶片色素水平下降及雄性不育。除此之外，rolc的转基因马铃薯和拟南芥也同样表现为雄性不育，而Spena等将Rolb基因与金鱼草tap1启动子融合后，不但使转基因植物雄性不育，还导致花药中IAA含量增加，GA含量下降，这类基因有可能通过破坏花粉细胞中的激素平衡引起花粉败育。

2.7 通过共抑制创造雄性不育

这一现象首先发现于矮牵牛中的CHS基因因同源序列的共抑制而导致花药和花色的改变。目前，通过共抑制导致雄性不育和干扰花的发育过程已进行了不少的研究。Taylor等观察到转查尔酮合酶基因的矮牵牛植株产生的畸形花药缺少黄酮类色素。我国学者利用此技术成功的创造了番茄、烟草的雄性不育。

2.8 双重转基因系杂交

这种方法是先把未来的母本分别导入两个不同的基因，其中一个是指导反式激活蛋白多聚酶表达的花药特异启动子，另一个是与反义RNA或多肽链连锁的反式激活蛋白的目标序列，这两个基因单独对雄性育性均没有影响，但通过杂交使他们结合到一起时，后代就会100%不育。用其做母本与未转基因的父本杂交，F1杂种中有75%的可育株。但是，这个途径需要人工去雄杂交，限制了其应用范围，只有那些去雄容易、繁殖系数高、有好的经济效益的蔬菜才可能利用。

2.9 其他方法

藤晓月等发现雄性不育性不育系与保持系花药中肌动蛋白的含量存在着显著差异。阎隆飞等将反义豌豆肌动蛋白基因与花粉P花药特异启动子连接转化小麦和番茄，得到了花药畸形和花粉无活力的植株。Tadege研究在有氧条件下，在丙酮酸脱羧酶和乙酰脱氢酶的作用下，植物体内产生了大量的乙醛，乙醛在花粉中大量的积聚，从而造成了玉米花粉的不育。Goetz等从烟草中克隆了Nin88及其启动子，将其启动子与反义Nin88相连转入植物，26%的转基因植物表现为败育，而其它74%的植株表现为种子数目减少。但是，这种基于扰乱植物正常生理代谢的基因操作所得到的植物雄性不育，常伴随着生命力下降、花期延迟、植株矮小等不良性状。此外，利用这种方法获得的雄性不育植株还有许多困难要克服。

3 蔬菜雄性不育基因工程

自从通过基因工程创造雄性不育的方法问世以来，已经在许多作物上获得了成功。在蔬菜育种方面，雄性不育基因工程的研究和应用起步较晚，到目前成功报道的仅有番茄、白菜等作物。我国在这方面的研究也取得了很大的进步。张宏、阎隆飞在番茄方面、余沛涛在大白菜方面以及沈革志、朱玉英在甘蓝方面的研究都获得了一定成就。

基因工程创造雄性不育技术结合传统的与现代育种，缩短了育种年限，并已经在蔬菜上取得了成功。我们相信随着研究的深入和生物技术的不断完善和发展，利用基因工程创造蔬菜雄性不育系的方法会更加简便、快速和有效，将杂种优势的利用领域引向更高的水平。