非组培遗传转化法在农作物上的应用

任海红，任小俊，王 英，刘学义

（1.山西省农业科学院经济作物研究所，山西汾阳032200；2.汾阳中学，山西汾阳032200）

自1983年第1例转基因植株成功获得以来，植物基因工程研究进入了蓬勃发展时期。转化技术方法已发展到20种左右，如农杆菌介导法、花粉管通道法、基因枪法、电击法、PEG法、显微注射法等，其中最理想的技术仍是农杆菌介导技术。

利用转基因技术培育转基因植物，主要的目的是培育抗病虫、抗除草剂、抗旱、耐盐碱的优质农作物新品种。转基因技术突破了物种的界限，可以将动物、微生物的有益基因转化到植物中。目前，已有一系列转基因作物品种形成，如抗虫棉、抗虫玉米、抗虫水稻、抗除草剂大豆、抗白叶枯病水稻等。植物基因工程技术在农作物品种改良和育种方面发挥着越来越重要的作用。

目前，植物遗传转化所采用的受体系统，大都依赖于细胞组织培养技术才能获得转基因植株。但由于组培周期长并存在一定的局限性，因而近年来发展起来一些非组培的转化方法。本文着重对几种非组培转化方法的技术原理及其在农作物上的应用进行了介绍，并对今后的发展方向进行了展望。

1 几种非组培转化方法的原理及其应用

1.1 真空渗透法

真空渗透法是一种原位真空渗入遗传转化方法。1993年，Bechtold等首先在拟南芥的转化中获得成功。该方法主要步骤为:在开花早期将拟南芥花浸入含农杆菌菌液的液体培养基中，然后用真空泵抽真空处理，再恢复常压，使农杆菌菌液渗入到植物组织内部。真空处理之后植株处于一种极度衰弱的状态，需平放于高湿环境中进行恢复性生长，然后转栽于正常生长条件下，收获种子，筛选、检测转基因植株。

Bechtold等建立了整株（in planta）原位真空渗入遗传转化方法，此后许多学者在拟南芥[1]和芸薹属的一些作物[2]上进行了大胆尝试。李晓等[3]以棉花花粉作为受体细胞，在农杆菌介导下将外源基因导入花粉中，然后通过人工授粉获得转化。它避开了传统基因转化方法所需的组培过程，含外源基因的花粉可与卵细胞自然结合，产生的转化体不存在转化与非转化细胞间的嵌合现象。

真空渗透法转化植物不需经过组织培养即可直接获得转化的种子，易于重复，可靠性高。目前，真空渗透法在拟南芥、白菜、油菜等的遗传转化中应用较多[4-5]。实验中，植物发育阶段、抽真空的强度和时间、农杆菌的浓度对转化效率都有影响。

1.2 Floral-dip法

Floral-dip法是在拟南芥真空渗透法的基础上发展起来的。在植株的花蕾期，将花序浸渍在含有表面活性剂的工程农杆菌菌液中，经表面活性剂的吸附和渗透作用，强化和刺激细胞的转化。

Clough等[6]首先在拟南芥中用浸蘸法转化获得成功。后来，Chung等[7]对拟南芥花序进行了农杆菌菌液直接喷雾（floral-spray）处理，同样获得了转化株，这是比Floral-dip法更为简便的转基因方法。在作物方面，刘琦[8]用此方法将CYCD2基因导入小麦中，进行了有意义的尝试。畅乃迪[9]尝试采用农杆菌介导的Floral-dip转化法，在大田中首次对玉米雄花进行遗传转化，并获得了成功。王翠艳等[10]首次运用Floral-dip法将植酸酶基因转入冀豆12，获得遗传转化率为1.18%～2.22%。虽然此方法在作物方面的应用并不是很成熟，但这些大胆的尝试对扩展该方法的应用领域、简便有效地提高作物的遗传转化效率奠定了一定的基础。

1.3 花粉管通道法

花粉管通道法是一种建立在不依赖于植物细胞组织培养的转化系统，是周光宇等[11]在20世纪80年代建立的。该技术利用开花植物授粉后形成花粉管通道，使得外源DNA能沿着花粉管渗入，经过珠心通道进入胚囊，直接将外源DNA导入尚不具备正常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞中，从而实现目的基因的转移。该方法可用于任何开花植物。据操作方式的不同，它通常有2种方法，即子房注射法和柱头滴注法。

子房注射法是指使用显微注射仪把外源DNA溶液注入到子房中，由于子房产生的高压力及卵细胞的吸收，使外源基因进入受精的卵细胞。刘博林等[12]采用合子期子房微注射法，将龙葵Atrazine抗性基因psbA导入对Atrazine敏感的大豆叶绿体基因组中，经直接用Atrazine涂抹叶片及叶片在较强光诱导下荧光动力学研究和间接分子杂交试验等检测方法鉴定，获得了转基因大豆植株。张国栋等[13]将玉米自交系和大豆品种东农36的DNA分别导入另一大豆品种中，其后代的突变率分别为10%和5.32%，出现了种子蛋白含量、株高、茎粗、结荚习性、倒伏性、每株分枝数与荚数、粒数与百粒质量等性状变异。余桂荣等[14]选择开花后0.5～2.0 h的小麦作受体进行转化，获得较高的结实率和转化率。李余良等[15]用子房注射法将Bt抗虫基因导入超甜玉米品种粤甜3号，获得了1株整合有Bt基因的转基因植株，转化率为9.09%。李远新等[16]以黄瓜品种津研4号为受体，以质粒pBI121为供体，建立起高效的黄瓜子房注射转化系统，试验表明，黄瓜授粉后12 h注入外源基因的转化率最高。魏爱民等[17]也用子房注射法得到抗虫转基因苗。田间子房注射转化法主要用于子房较大的作物，如棉花、玉米、瓜类。由于该方法转化偶然性比较大，因此，成功的关键是注射时间及注射位置和深度的把握。

柱头滴注法是先将正在大量授粉的花柱柱头切去，然后滴入DNA（DNA的浓度要大于子房注射法）。周春江等[18]利用柱头滴注法将兔防御素NP-1基因导入小麦中，经田间抗病虫鉴定，这些植株对于白粉病、叶锈病和条锈病有较强的免疫力和抗性。王永芳等[19]采用柱头滴注法将谷子的抗逆相关基因DNAj转入小麦中，获得了成功，为创造抗逆性改良的小麦新材料奠定了基础。在大豆方面，雷勃钧等[20]将半野生大豆的总DNA导入到栽培大豆中，育成我国第1个利用花粉管通道法获得的大豆品种黑生101。2006年，刘德璞等[21]以吉林20号、吉林30号、吉林45号为供试材料，通过花粉管通道法，将雪花莲凝集素GNA基因进行转化，通过接蚜鉴定和PCR检测，从中筛选出转基因植株，后代分离符合孟德尔规律，转化率约为1%。刘建凤[22]在花粉管通道法的基础上建立并优化了大豆柱头滴注法。其具体做法为：选取大豆自花授粉6～8 h后的完全开放的花朵，首先用镊子去除同一节上不符合要求的花，然后将符合要求的花用镊子夹去花瓣，接着用剪刀完全剪去花柱，将6 μL转化溶液滴加在子房伤口处，如气温较高，补滴1次，转化率可达3.18%。赵宝存等[23]在小麦授粉后2～4 h，用剪刀剪去柱头的1/3，将T型细胞质雄性不育保持系75-23369B线粒体的基因文库的不同重组子DNA滴在断面上。结果显示，重组子ME252和ME317的转化后代变成可育。张森燕等[24]将构建好的ZmPti1基因的正义表达载体和RNAi载体，通过柱头滴注法分别转化到玉米自交系178中。经检测分别得到15株和18株转基因植株。此法适用于较小花器的作物。

实际操作中，作物所采用的转化方式，注入DNA溶液的量均根据子房的大小而定。除了应考虑导入方式对花器（子房、柱头）伤害最小外，导入时间和时期的选择也至关重要。对于有些植物开花授粉时间不易控制的，可以先进行人工授粉，再在一定的时间梯度内进行转化处理。

1.4 胚性组织浸染转化法

近年来发展起来一种浸染转化法，不同的研究单位方法不同。其原理是根据种子的发芽生理，将外源DNA随着种子或幼胚的萌发或生长，进入种胚细胞，在当代就能表现出变异，并得到遗传。

Rohini等[25]将种子中的一个子叶去掉，把带有胚轴的另一片子叶萌发后用无菌针在胚轴处轻轻划几下，在农杆菌中浸泡几分钟，然后共培养、漂洗，子叶继续萌发、生苗，收获种子进行转基因后代的检测。Rohini等[26]用该方法在花生上获得成功，转化效率达3.3%～5.3%。王成杰[27]初步建立了利用农杆菌转化小麦萌芽种子的方法，并证明外源基因已转移到植物细胞中。山西省农科院孙毅等发明了以萌动胚为受体的转化方法，梁雪莲等[28]用此方法与花粉介导、子房注射法在玉米上转化bar基因，从转化率与操作简便程度上进行比较，认为花粉介导优于萌动种胚法，且二者又优于子房注射法。王昌涛等[29]成功地建立了一个农杆菌介导玉米萌动胚遗传转化新体系，具体做法为：把划好的玉米萌动胚放入YEB液体培养基中，28℃，220 r/min振荡24 h，然后把种子放在MS固体培养基上共培养3 d，再转入带有潮霉素的筛选培养基中7～10 d，经过筛选后的幼苗移栽到温室中。

胚性组织浸染转化法克服了组织培养再生难、转化率低的缺点，不需要高昂的仪器设备，是高频、简单、快捷的非组培遗传转化途径，便于一般科研院所推广应用。但该技术还需要在实践中不断完善。

2 问题及展望

本文所述的植物非组培转化方法具有简便、快捷、无需组培等优点，但这些方法有的还处于尝试阶段，在作物上应用还不成熟，转化效率还很低，不能满足作物育种和功能基因研究的需要。因此，对非组培转化受体系统的优化和转化过程中的影响因素仍需进一步研究。目前，花粉管通道法相对成熟，且易于实现大规模基因转化，是一种很有潜力的作物遗传转化方法。目前，花粉管通道法在我国已成为与农作物育种应用结合最为密切的技术，是安全高效的分子育种途径，是生物技术育种中的一个重要研究领域。

随着分子生物学和植物基因工程的不断发展，以转基因技术为手段的植物遗传改良成为农业生物技术育种的重要途径。而转基因作物的安全性越来越受到人们的重视，其中，筛选标记基因和载体骨架序列是影响转基因作物安全性评价的重要因素。基因枪和农杆菌转化法目前均较难实现无载体骨架序列无选择标记基因的转化，而花粉管通道法等非组培方法可以解决该问题。因此，随着非组培转化方法的改进、转化效率的提高，植物非组培转化方法将为作物分子育种和基因功能研究提供有力的方法保障。

［1］ Cecchine E，Gong Z H，Geri C，et al.Transgenic Arabidopsis lines expressing gene VI from cauliflower mosaic virus variants exhibit arange of symptom-like phenotype and accumulate inclulate inclusion bodies[J].Mol Plant Microbe Interactions，1997，10（9）：1094-1101.

［2］Cao M Q，Liu F，Yao L，et al.Transformation of pakchoi（Brassica rapa L ssp chinensis）By Agrobacteriun infiltration[J].Mol Breeding，2002（6）：67-72.

［3］ 李晓，王学德，朱玉贤，等.农杆菌真空渗透法转化花粉获得棉花转 acsB 基因植株 [J].作物学报，2002，28（5）：709-712.

［4］巩振辉，Milner J J，何玉科.拟南芥基因转移新方法——真空渗入法的研究[J].西北植物学报，1996，16（3）：277-283.

［5］ 曹传增，刘凡，赵泓，等.影响不结球白菜真空渗入转基因频率的几个因素[J].华北农学报，2003，18（4）：35-38.

［6］ Clough S J，Bent A F.Floral dip:a simple method for A-graobacterium-meidated transformation ofArabidopsis thaliana[J].The Plant Journal，1998，16（6）：735-743.

［7］ Chung M H，Chen M K，Pan S M.Floral-spray transformation can efficiently generate Arabidopsis Transgenic Plants[J].Transgenic Res，2000，9（6）：471-476.

［8］ 刘琦.基因枪法和农杆菌-花器浸蘸法将CYCD2基因导入小麦的研究[D].雅安：四川农业大学，2007.

［9］ 畅乃迪.Floral-dip转化优良玉米自交系初探 [D].雅安：四川农业大学，2009.

［10］ 王翠艳，丁东风，于晓菊，等.Floral-dip法在大豆遗传转化中的应用研究 [J].南开大学学报（自然科学版），2010，43（1）：34-43.

［11］ 周光宇，翁坚，龚蓁蓁.授粉后外源DNA导入植物的技术[J].中国农业科学，1988，21（3）：12-61.

［12］ 刘博林，岳绍先，胡乃壁，等.龙葵抗性基因向大豆叶绿体的转移及在转基因植株中的表达 [J].中国科学，1989，19（7）：699-705.

［13］ 张国栋，赵长山.将外源DNA注入幼荚实现大豆遗传转化[J].大豆科学，1994，13（3）：268-273.

［14］ 余桂荣，尹钧，任江萍，等.小麦花粉管通道法转基因研究[J].麦类作物学报，2004，24（2）：15-19.

［15］ 李余良，胡建广，苏菁，等.子房注射法将Bt基因导入超甜玉米[J].玉米科学，2005，13（1）：41-43.

［16］ 李远新，王关林，葛晓光.黄瓜授粉后外源基因直接导入技术研究[J].华北农学报，2000，15（2）：89-94.

［17］ 魏爱民，张文珠，杜胜利，等.黄瓜花粉管通道法抗虫基因导入及卡那霉素抗性筛选 [J].华北农学报，2008，23（6）：54-57.

［18］ 周春江，葛荣朝，赵宝存，等.利用花粉管通道法将兔防御素NP-1基因导入小麦的研究 [J].华北农学报，2007，22（2）：26-28.

［19］ 王永芳，张军，崔润丽，等.利用花粉管通道转化谷子DNAj基因获得转基因小麦[J].华北农学报，2009，24（2）：17-21.

［20］ 雷勃钧，钱华，李希臣，等.通过直接引入外源DNA育成高产、优质、高蛋白大豆新品种黑生101[J].作物学报，2000，26（6）：725-730.

［21］ 刘德璞，袁鹰，唐克轩，等.大豆花粉管通道技术转化雪花莲凝集素（GNA） 基因 [J].分子植物育种，2006，4（5）：663-669.

［22］ 刘建凤.大豆子房滴注转化方法的研究及耐盐基因（AINHX1）的转化[D].大连：大连理工大学，2009.

［23］ 赵宝存，葛荣朝，沈银柱，等.小麦T型细胞质雄性不育保持系线粒体DNA片段转化不育系的初步研究[J].华北农学报，2004，19（4）：21-23.

［24］ 张森燕，吴忠义，张秀海，等.ZmPti1基因正义和RNAi表达载体的构建及其转化玉米的研究 [J].华北农学报，2008，23（5）：1-5.

［25］ Rohini V K，Sankara R K.Embryo transformation，a practical approach ofrealizingtransgenic plants of safflower（Carthamus tinctorius L）[J].Annl Bot，2000，86：1043-1049.

［26］ Rohini V K，Sankara R K.Transformation of peanut（Arachis hypogaea L）：a non-tissue culture based approach for generatingtransgenic plants[J].Plant Sci，2000，130：41-49.

［27］ 王成杰.农杆菌介导小麦非组培转化方法的探讨 [D].北京：中国农业大学，2004.

［28］ 梁雪莲，郭平毅，孙毅，等.玉米3种非组培转基因方法转化外源 bar 基因研究 [J].作物 学报，2005，31（12）：1648-1653.

［29］ 王昌涛，赵玉锦，李坤远，等.农杆菌介导玉米萌动胚遗传转化新体系的建立[J].华北农学报，2007，22（5）：110-113.