现代微生物技术在乳品工业中的应用

■ 曾庆坤 李 玲 中国农业科学院广西水牛研究所

据考证，人类利用微生物来制作乳制品已经有4000 多年的历史。人们在实践中开始了解微生物的生长特性及规律，并逐步掌握了利用微生物的机能、代谢产物等来加工产品的技术。19世纪以来，随着微生物学的不断发展，微生物技术在乳品工业中得到了比较广泛的应用。20世纪下半叶以来，生物技术发展异常迅猛，从而使微生物的研究从细胞水平发展到分子水平，以转基因、基因芯片、PCR技术等为基础的现代微生物技术在乳品工业中逐步得到了应用，促进了乳制品加工和质量控制技术的发展。

1 现代微生物技术的发展现状

1.1 微生物的快速检测技术[1]

随着食品工业的快速发展，以及消费者对食品安全日益的关注和重视，传统的微生物检测方法已难以满足人们的需求，现实社会迫切需要一些灵敏度更高，特异性更强，更加简便快捷的食品安全检测技术和方法。此外，随着我国食品对外贸易的不断扩大，建立和完善与之相适应的食品微生物安全检测技术和体系也迫在眉睫。因此，近年来不少机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，并已开发了一些新的快速检测技术，使传统的培养水平逐步向分子水平迈进。

1.1.1 免疫学技术

免疫学技术是利用抗原和抗体的特异性反应原理，通过病原物刺激使机体产生免疫应答，即产生免疫球蛋白（抗体）的方法，再辅以免疫放大技术来鉴别细菌。免疫方法的优点是样品在进行选择性增菌后，不需分离即可采用免疫技术进行筛选。由于免疫法的灵敏度较高，检出量低，检测时间短，因此，在食品微生物检测中应用较广。通常根据检测技术的不同可分为免疫扩散反应、凝集反应、免疫荧光反应、酶免疫等测定方法。

1.1.2 核酸探针技术

核酸探针是指带有标记的特异DNA片断，根据碱基互补原则，核酸探针能特异性地与目标DNA结合，然后再用特定的方法测定标记物，从而达到检出目标微生物的目的。探针标记方式分为放射性标记、非放射性标记。放射性标记的核酸探针的特异性非常强，检测病原微生物速度要比常规方法快很多。但目前用得较多的是用生物素——抗生物素蛋白系统标记的非放射性核酸探针，该探针已在沙门氏菌、产肠毒素大肠杆菌及乙型肝炎病毒的检测中得到很好的应用。

1.1.3 PCR技术

虽然基因探针技术检测速度较快，但由于灵敏度不够高，需要对样品进行一定时间的培养，而且每一种探针只能检测一种菌，这影响了基因探针技术的进一步应用。1983年，Millus和 Cetus发明了扩增DNA或增加样品中特殊核苷酸片段数量的方法：聚合酶链式反应，即PCR技术，这在一定程度上克服了基因探针所存在的问题。该方法通过加热使双链DNA裂解成2 条单链，成为引物和DNA聚合酶的模板；然后降低温度，使寡聚核苷酸引物与DNA分子上的互补序列退火；然后升高温度，酶促延伸引物与DNA配对合成模板。如此重复循环上述加热变性双链、引物退火和链延伸的过程，每次循环都会将靶 DNA扩增1 倍，典型扩增经过40 次循环能引起100 万倍的扩增。最后用凝胶电泳、比色测定及紫外核酸检测仪等观察扩增结果。

PCR技术是一项全新的快速、灵敏、准确的检测技术，有的准确率高达100%，如用同位素标记2 种基因（Lac Z和Lam B）的探针做PCR反应，检测水源中的E.Coli。因此，PCR技术在细菌诊断方面具有广阔的应用前景。目前已有自动化PCR检测试剂盒，使用非常方便。如美国杜邦快立康公司的BAX+病原菌检测系统，可检测沙门氏菌、大肠杆菌0157、单增李斯特菌等。

1.1.4 生物芯片技术[2]

生物芯片技术是随着“人类基因组计划”（human genome project，HGP）的进展而发展起来的。生物芯片技术包括基因芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、组织芯片，以及元件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。

基因芯片（gene chip）技术是20世纪90年代兴起的前沿生物技术。基因芯片也叫DNA芯片、DNA微阵列（DNA microarray）、寡核苷酸阵列（oligonucleotide array），是指采用原位合成（in situsynthesis）或显微打印手段，将数以万计的DNA探针固化于支持物表面上，产生二维DNA探针阵列，然后与标记的样品进行杂交，通过检测杂交信号来实现对生物样品快速、并行、高效地检测或医学诊断。由于常用硅芯片作为固相支持物，且在制备过程运用了计算机芯片的制备技术，所以称之为基因芯片技术。由于基因芯片的信息量大，操作简单，可靠性好，重复性强，以及可以反复利用等，因此，被广泛应用于食品检测中有害微生物和转基因成分的鉴别。与传统的细菌培养、生化鉴定、血清分型等检测方法相比，基因芯片技术具有以下优点：一是基因芯片可以实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；二是操作简便快速，整个检测只需4 h就可以得出结果，而传统方法一般需4～7 天；三是特异性强，灵敏度高。

1.2 航空育种技术[3]

传统上，微生物育种通常采用诱变育种方法，诱变剂主要分物理和化学两大类。物理诱变剂有紫外线、X射线、γ射线（Co60）等。化学诱变剂有亚硝酸、硫酸二乙酯、甲基磺酸乙酯和亚硝基胍等。

航天育种是利用微生物经大剂量、高强度宇宙射线辐射及微重力场作用后发生变异来进行诱变育种的新技术。该方法是将微生物细胞悬浮液送入高空，停留一定时间后返回地球进行培养；然后采用适当的方法淘汰负变异菌株，选出一些性状优良的正变异菌株；再根据目标产品特点复筛出生命力旺盛，生产速度快，代谢产物得率高，以及品质优良的菌株，并排除生理变异与遗传变异，就可得到经航天培育的优良微生物菌种。航天育种具有无污染，操作方便的优点，效果非常明显。

我国从20世纪90年代开始通过高空气球搭载，将微生物送入太空进行诱变育种，并成功返回。随着我国航天技术的发展，未来我国食品微生物诱变育种将会取得更大的成效。

1.3 转基因技术[4]

基因工程技术是现代生物技术发展的基础，微生物是应用基因工程技术最基本且重要的—环，因此，转基因微生物的构筑、开发是所有转基因食品研究的基础。目前，一些利用转基因微生物生产的酶（如凝乳酶）已在食品工业中得到了广泛的应用。这些酶具有产量高，品质高，稳定性好和价格低等优点。基因工程凝乳酶的研究始于1970年，目的在于改善干酪的生产方法与提高凝乳酶性能，1998年第1 个转基因微生物生产的凝乳酶产品面市，开始在干酪生产中试用。基因工程凝乳酶产品的纯度高，且含 100%凝乳酶 （小牛胃萃取液仅含70%～90%凝乳酶），所制造的干酪在产品得率与品质上均优于传统小牛胃凝乳酶制造的干酪。美国已有超过70%的干酪是用转基因微生物生产的凝乳酶制造的。

2 现代微生物技术在乳品工业中的应用

2.1 生奶中微生物的检测和鉴定

在生奶的收购、加工和产品质量控制等过程中，微生物检测是一项必不可少的同时又是比较繁杂的工作。此外，由于传统微生物检测技术耗时比较长，给乳制品生产管理和产品品质控制带来了许多困难和问题。利用免疫学和基因探针、基因芯片等技术可实现乳制品中微生物尤其是致病微生物的快速检测，原本需要几天的检测时间，可缩短至几小时，这样可使产品在出厂前完成检测工作，确保产品的质量安全。

此外，利用基因技术和PCR技术可对微生物进行鉴定，如乳酸菌和转基因微生物的鉴定，这些方法具有速度快，准确性高，稳定性好等特点，目前已得到很好的应用。

2.2 酶制剂的生产

凝乳酶、乳糖酶、脂肪酶及其它蛋白酶、肽酶等是乳品工业常用的酶制剂。凝乳酶主要用于干酪生产，以往主要使用小牛皱胃酶，然而，提取小牛皱胃酶需要宰杀大量的犊牛，其产量受到一定的限制，难以满足干酪生产不断增长的需要。经过不断的探索，人们发现一些微生物产生的酶可应用于干酪生产，有的微生物还能生产纯凝乳酶。用乳糖酶处理牛奶可使牛奶中的乳糖水解为半乳糖和葡萄糖，解决乳糖不耐症及乳糖在冰淇淋中砂状结晶析出的问题。在乳制品加工时，添加适量的脂肪酶可增加干酪和黄油的香味，这样既可节约黄油的用量，还可以提高产品的风味。在干酪中添加酶，还可缩短干酪的成熟时间。

采用微生物基因工程技术可生产大量乳品工业用酶，如将牛凝乳酶原生产基因植入大肠杆菌，用发酵法生产真正的凝乳酶，该技术已获成功，转基因凝乳酶已大量应用于干酪生产。随着蛋白质工程技术的快速发展，不久的将来会有越来越多更稳定，特异性与催化效率更佳的，利用转基因微生物生产的酶应用于工业化生产。

2.3 益生菌的改良

益生菌是一类可以在人或其它寄主体内（主要是肠道）定植，有利于人体或寄主健康的微生物。常见的益生菌主要有乳酸菌、双歧杆菌等，这些益生菌的摄入和在人体肠道内定植，不仅有利于改善肠道内上皮细胞和黏膜细胞的粘附性，而且通过分泌一些抗菌物质抑制有害菌群的生长，从而起到保健作用。

通过益生菌的基因组学研究，可掌握益生菌功能特性的控制基因，从而通过转基因技术获得优良性状的益生菌菌株。此外，还可对微生物的代谢途径进行调控，从而达到精确改造益生菌的细胞特性的目的。例如，经过改良的乳酸菌，可以通过一个相对简单的代谢途径，把乳糖转化为乳酸，从而适应高乳糖的生长环境。另外，还可通过改造代谢途径来生产不同风味的酸奶，这对于进行市场的差异性划分是非常有益的[5]。

2.4 功能活性产品的生产

研究表明，乳蛋白经水解后可产生一些多肽类物质，这类物质具有增强免疫功能，抗凝血，抗过敏，降血压和降低胆固醇等功效[6]。利用不同的蛋白酶可将乳蛋白分解成特定的、具有不同功能特性的多肽。利用微生物发酵法，即通过微生物生长过程中产生的胞内、胞外酶的作用，也可将乳蛋白分解成具有一定生物活性的多肽物质[7]，而通过转基因等技术可得到特异性强的高产菌株。

2.5 细菌素的应用

乳酸链球菌肽（Nisin）作为一种多肽类物质，可抑制一些细菌的生长，同时，这种物质添加于食品中不会被其中的微生物分解，对人体无毒害作用。但乳酸链球菌肽对蛋白水解酶 （胰酶、唾液酶、消化酶等）很敏感，人食用后在消化道内很快被水解成氨基酸，并且不改变肠道内的正常菌落，也不会与常用的其它抗生素（如青霉素、链霉素等）产生交叉抗性，是一种安全的防腐剂，可以用作乳制品的保鲜剂。采用基因重组技术构建高产、广谱抗性菌株，可以获得抗菌效果更好的天然防腐剂。

2.6 合成香味物质，改善产品的风味

许多微生物如细菌、真菌、酵母菌在生长过程中都能够产生香气物质，利用微生物这一特性可以合成许多风味物质。如合成含N的杂环类吡嗪化合物，可产生菠萝、马铃薯、爆米花、坚果味；内酯化合物具有水果味、可可味、奶酪味及坚果味；萜烯类化合物主要有香茅醇、香味醇、里那醇等；细菌菌株还能够降解丁香醛产生香兰素，可用作产品的增香剂[8]。用微生物合成法生产香味物质具有生产工艺简单，成本低，产品品种多以及风味柔和等特点，这些香味物质可用于开发不同风味的乳制品，以满足不同消费者的需要。

3 前景展望

随着生物技术的进一步发展，现代微生物技术将会在乳制品卫生质量检测，益生菌的改良和选育，新型发酵乳制品的开发，酶及添加剂的生产，以及产品质量控制等各方面得到广泛的应用，这对于促进乳品工业科技进步，开发新型乳制品，提高行业工作效能，降低运行成本，有效控制产品质量和保障乳品质量安全等都具有非常重要的作用。

[1]李勤.食品微生物检测技术和方法概论.食品工程，2006（4）：44-46.

[2]王志存，葛长荣.基因芯片技术在病原性食品微生物检测中的应用.肉类工业，2006（12）：40-42.

[3]李大锦，王汝珍.航天育种：21世纪酿造微生物诱变育种的革命.上海海洋，2002（3）：16.

[4]朱文深.透视国际转基因微生物与其产物.中外食品工业信息，2003（3）：6-7.

[5]柳莹.乳酸杆菌改良技术的新进展.食品研究与开发，2002，23（6）：28-31.

[6]梁金钟，陈成，徐速等.乳蛋白生物活性肽的开发与利用.中国乳品工业，1999，27（1）：28-29.

[7]赵云财，滕波，吴镝等.微生物发酵法生产乳蛋白活性肽口服液.中国乳品工业，2004，32（8）：24-26.

[8]齐军茹，苏景如，彭志英.生物技术在食品风味物质生产中的应用.食品科技，2002（9）：9-11.