人乳头状瘤病毒感染与宫颈癌的研究进展

周 瑾 吴清明综述 黄国香审校

宫颈癌是造成目前世界妇女死亡的主要疾病之一，据世界卫生组织统计，全世界每年有25万妇女死于宫颈癌，约50万宫颈癌新发病例[1]。宫颈癌病因研究一直处于探索阶段，自Laverty 在电镜中观察到子宫颈癌活检组织中存在人乳头状瘤病毒(human papillomavirus，HPV)颗粒，Zur Hausen等提出人乳头状瘤病毒与子宫颈癌发病可能有关的假说[2]以来，国内外学者对子宫颈癌与HPV感染关系进行了大量研究，发现HPV感染是宫颈癌的主要流行因素，90%以上宫颈癌是由HPV感染引起[3]。许多专家关于宫颈癌发病的病因越来越倾向于多因素论，认为宫颈癌的病因因素还包括了多孕、多产、性行为、性传播性疾病、性激素、吸烟、口服避孕药等[4，5]，其中HPV感染是子宫颈癌的首要病因。

1 HPV的结构分型及感染

1.1 HPV的结构与分型

HPV属多瘤空泡病毒科家族，是一组体积较小的环状双链DNA病毒，由DNA核心和蛋白衣壳组成的无包膜病毒[6，7]。基因组有8～10个开放读码框架(ORF)，包括3个功能区域:①早期区(E)含有8个开放读码框，约有450 kb组成，其编码产物依次为E6、E7、E1、E8、E2、E4、E3和E5。参与病毒DNA复制、转录和细胞转化，是维持病毒复制、编码病毒蛋白和细胞内病毒高拷贝数的基因。其中E1和E2编码蛋白可特异结合LCR特定的序列，调节其他基因的转录； E4编码蛋白调节病毒的复制和成熟，并具有破坏宿主细胞骨架的作用。E6和E7基因分别编码含150个氨基酸和100个氨基酸的病毒原癌蛋白，与病毒复制的调控及细胞恶性转化密切相关。②长控制区(LCR)，又称为上游调控(URR)或非编码区(NCR)，约由1 000 bp组成，位于L1和E6之间，包含DNA复制起始，增强元件和转录增强序列，是主要的病毒转录调控区[8]，通过与转录因子的相互作用，调节早期区基因的转录，与病毒复制转录的调控有关。③晚期区(L)，位于53和89基因图单位之间，编码2个结构蛋白，即主要核壳蛋白(L1)和次要核壳蛋白(L2)，L1具有高度保守性，是主要的种特异性抗原，具有较强的免疫原性，能刺激机体产生中和抗体IgG、IgA，可使机体免受相应病毒的攻击。而L2具有特异性，反映HPV抗原的多态性[6，9]。

DAN序列分析发现HPV至少有100多个基因型，将对人类生殖道黏膜有感染力的有30多种[3，10]。根据其致病力的大小，分为高危型和低危型两类:①低危型:6、11、40、42、43、44、54、61、70、72和81等，主要引起生殖器疣；②高危型:16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、66、68、73和82等[11]，最主要的有5型：16、18、31、33、45[3，12]，主要引起宫颈癌及宫颈上皮内瘤变(cervical intraepithelial neoplasia，CIN)。宫颈鳞癌(SCCA)主要感染HPV16型，HPV18则主要与宫颈腺癌(AC)有关[6，9]。

1.2 HPV感染

宫颈癌是感染性疾病，已证实HPV是宫颈癌的主要致病因子[13，6]，即HPV感染是子宫颈癌发生的必要条件[2，4]，特别是高危型HPV感染与宫颈癌的发生有明确关系。感染高危型HPV最危险因素是性伴侣的数目，性伴侣越多感染几率越大，另外吸烟和多产也会增加感染高危型HPV的机会[12]。高危型HPV持续感染或病毒清除会导致宫颈病变的进展或消退。大多数研究者认为，HPV负荷量与宫颈病变进展有一定关系[14]。Jo L.K.Cheung等[15]对92例感染HPV52妇女观察发现，宫颈病损程度与HPV52病毒载量成正相关。但HPV感染与宫颈癌的临床分期和组织学分级均无相关性[16]。

HPV首先经子宫上皮基底层细胞和附基底层细胞感染。在子宫颈局部的HPV主要侵袭鳞状上皮和柱状上皮交接部和主要由菲薄的未成熟的基底层和附基底层细胞组成的移行带(TZ)。当分裂活跃的上皮细胞被感染后，病毒以裸露的DNA残基形式潜伏于细胞核内，病毒DNA复制与正常细胞分裂同步进行。此时，HPV感染的细胞形态仍正常，因它不产生完整病毒，故潜伏性感染的患者可仅携带病毒而不感染他人[9]。对于约80%的感染者，感染是暂时的，并不发展为CIN，病毒在6～8个月内会被清除。另外20 % 感染者体内的病毒不会清除，感染持续存在，最终导致CIN 的形成，或从CINⅠ(轻度非典型增生)发展到CINⅢ(重度非典型增生)甚至宫颈癌。但若感染高危型HPV，免疫功能强的患者，宫颈癌的发生率较低。高危型HPV感染产生的中和抗体反应能保护这些妇女免于发展成为CIN患者。当患者免疫功能减退或HPV侵袭力较强时，感染的上皮细胞产生大量新病毒，引起感染扩散和上皮细胞的不典型增生。低危型HPV感染也可导致CINⅠ及CINⅡ，然而这些病损从不或极少发展为CINⅢ级和宫颈癌[9，17]。CIN是1个有时空概念的病变，宫颈上皮不典型细胞可以逆转成正常细胞，也可以转变为浸润癌，这些变化取决于不典型增生细胞的生物学行为，或正常宫颈细胞感染HPV后的损伤程度[18]。

目前，HPV感染患者逐渐年轻化，25岁以下女性中HPV阳性率相对较高，而30岁以上者相对较低[19]。由于HPV感染的年轻化，使宫颈癌的发生率呈上升趋势，其中80%以上发生在发展中国家[3]。因此，对宫颈上皮内瘤变(CIN)、HPV 感染的处理，是防治宫颈癌的关键[19]。

2 HPV感染与宫颈癌发病机制的关系

在HPV感染的上皮细胞中，环状HPV病毒通过在El、E2的ORF断开，并线性化插入至人体上皮细胞染色体上[6，20]，而E6、E7则整合于宿主细胞中起作用。整合事件对宿主基因组是随机的，对病毒基因组是特异的。HPV环链最常见在E1或E2的开放读码框内断裂，并导致部分或全部E4、E5、L1和L2丧失，而仅有E6和E7整合入宿主DNA[20]。整合也发生在端粒酶催化亚单位(hTERT)的促进子和上游区域，且整合部位毗邻病毒的增强子，可能增强hTERT表达[21]。在良性或癌前病变中HPV一般为游离型感染，而在恶性肿瘤中则为整合型感染[6，21]。

HPV致癌大致有如下几个机制:①早期基因的表达激活细胞的增殖，病毒基因组与宿主染色体发生整合，E1、E2基因被破坏，从而导致E6、E7基因的表达失去控制，呈持续表达和过度表达。E6和E7是强力的细胞转化和致癌基因。②病毒基因组的整合可能会激活原癌基因。如c-myc、C-fos、C-jun等，致使细胞恶性转化。石玲玲等[22]研究发现HPVl6/18阳性患者Pinl，CyclinDl的阳性表达率较高。在宫颈癌发生发展过程中，肽基脯氨酰顺反异构酶Pinl过表达及其功能异常所致Cyclin D1过表达是Pinl促宫颈上皮细胞转化增殖的分子机制之一。Pinl与HPV均可通过Ras途径而激活C-jun，经C-jun信号通路激活CyclinDl的启动子促进CyclinDl转录，并通过诱导CyclinDl构型改变阻止CyclinDl从胞核内迁移至胞浆降解，促进宫颈上皮细胞转化增殖。③HPV与抑癌基因：E6、E7蛋白分别与细胞内肿瘤抑制物p53和Rb结合是HPV致癌的重要机制。p53是重要的基因转录激活物，正常宿主细胞DNA受损时，p53基因活化，促使细胞分裂停滞于G1和G2期，以便DNA修复和防止基因突变；高危型HPVE6蛋白与野生型p53两者极易结合使p53快速降解、失活，封闭了p53功能，解除细胞增殖抑制，使细胞过度增殖而导致肿瘤的发生。Rb是另1种重要的抑癌基因，正常低磷酸化的Rb蛋白可与E2F结合而抑制基因表达。Ras相关区域家族1A(RASSFIA)基因是新近克隆出来的1种肿瘤抑制基因，调节细胞周期和细胞凋亡。燕杰等[16]研究发现，RASSFIA基因的LOH阳性率在HPV感染阳性组明显高于阴性组，证明HPV感染与PASSFIA的LOH共同作用在宫颈癌的发展过程中。RASSFIA基因的改变是宫颈癌发生过程中的较晚期事件。④HPV与端粒酶:端粒酶是使端粒延伸的反转录DNA聚合酶，它的过度表达在细胞永生化和人类恶性肿瘤的发生中起关键作用[6，21]。正常情况下端粒酶不表达，宫颈癌组织中端粒酶阳性率达92%，且多为强阳性。HPV感染与端粒酶激活有关，HPVE6/E7的转录基因已经证明可以诱导端粒酶的活性和永生化。端粒酶的激活是高危型HPV感染子宫颈上皮后有CIN向癌转化的过程中相当关键的步骤[6]。⑤HPV与免疫:HPV感染机体后机体免疫系统会受到影响。高危型HPV感染后，NK/T细胞活性降低，局部LC数目减少，故发生癌变的危险性增大；与此同时，HPV的结局与机体免疫状态有很大关系，生殖道黏膜免疫系统对HPV的防御反应主要是局部体液免疫。在动物模型中，体液免疫可控制HPV的复发及感染速度[6，21]，并且被病毒感染的宿主细胞可通过自杀机制，用以阻止新的病毒颗粒复制[6，9]。细胞免疫在调节HPV感染反应中起重要作用，HPV只有逃避宿主细胞的调控才可以继续复制。造成HPV相关肿瘤免疫逃逸的机制有:①E1蛋白的17-37位氨基酸与p48结合，阻断a-IFN介导的信号转导，从而抵抗干扰素的抗病毒、抗肿瘤作用。②HLA-Ⅰ类分子抗原表达下调、缺失或其基因结构的改变，导致对癌抗原提成、识别和杀伤作用发生障碍。③MCH-I类分子表达异常。在HPV相关的原位转移、复发的宫颈癌中，高频出现主要组织相容性复合体-I(MCH-I)类分子的等位基因缺失，MCH- I类分子下调可使这些癌细胞逃避机体的免疫监视。

3 HPV的检测方法

随着HPV与子宫颈癌病因关系广泛受到重视，HPV检测方法也在不断地改进，如细胞学检查、斑点印迹法、核酸杂交、CPR和杂交捕获法、生物芯片技术等。

细胞学检测虽具有很高的特异度，但敏感性不高[6，23]；组织学检测在HPV阳性细胞学正常的个体中很少发现病毒膜抗原[24]；血清学检测血清中的抗体滴度较低，很难检测到。 HPV基因组检测是目前应用较多的检测方法，包括：① PCR检测:是目前较好的HPV 检测方法，具有很高的灵敏度。通过计算机辅助设计HPV各亚型引物后，便能够有效特异地扩增相应的亚型。可通过多种方法验证HPV型别。② 核酸杂交检测:核酸杂交的特异性和灵敏度显著高于传统检测方法，并且还可应用特异性针对HPV进行分型。目前已有多种用于HPV DNA的核酸检测方法如斑点杂交，原位杂交，杂交捕获DNA序列等。杂交捕获(HC)是联合应用高效的液相杂交法和敏感的化学发光信号扩增系统进行检测包括杂交捕获管试验(HC-Ⅰ)和第二代杂交捕获试验(HC-Ⅱ)2种方法。HC-Ⅰ可检测9种高危型HPV，包括16、18、3l、33、35、45、5l、52、56；HC-Ⅱ扩大到对13种高危型HPV，包括16、18、3l、33、35、39、58、59、68均可进行定性定量检测。具有灵敏度高、特异性好、重复性和客观性强等优点，特别适合大规模的人群筛查，目前较为理想的检测方法[24，25]。③生物芯片技术：是新兴的高度集成化的分析和研究技术，在PCR检测法基础上，结合了光学、化学、分子生物学等多学科手段，通过芯片制备、样品标记、杂交反应和结果检测等过程得出结果。基因芯片可以确切将HPV分型，和判断多重感染。基因芯片技术在HPV的分型诊断中具有独特的优势，是理想方法。其特点为高通量、敏感性高、特异性强，但价格昂贵[25]。

4 HPV的基因治疗研究进展

鉴于HPV感染与宫颈癌发生密切相关，研发HPV疫苗现已成为研究热点。HPV疫苗分为预防性疫苗和治疗性疫苗两类[26]。

⑴ HPV预防性疫苗:主要以HPV病毒的结构蛋白质形式存在，一般由病毒衣壳蛋白L1或L1+L2组成，在细胞内可自我组装成空心病毒样颗粒(VLPs)。它具有与完整病毒相同的抗原空间表位，可激发机体的CD4+ 淋巴细胞介导的体液免疫反应，刺激机体产生保护性中和抗体；可阻断HPV感染皮肤和黏膜。VLPs作为预防性疫苗在美国和拉丁美洲已开展临床Ⅲ期实验。

⑵ HPV治疗性疫苗：可清除由HPV感染所引起的肿瘤残存病灶、宫颈不典型增生(CIN)及生殖器尖锐湿疣，阻断低危型病变向高危型及癌症的转变过程。有多肽疫苗、融合蛋白疫苗、嵌合疫苗、DNA疫苗和RNA疫苗等。肽段疫苗最主要的代表为E7肽段疫苗，采用HLAA0201结合肽，主要是E7蛋白第11～20和86～93氨基酸2段分子肽段，临床试验证实多肽疫苗对癌前病变及宫颈癌有一定的治疗效果；嵌合蛋白疫苗L2E7E6是由HPV16型早期蛋白和晚期蛋白组成，动物实验显示其能有效的抑制肿瘤的形成。融合蛋白疫苗:由HPV早期蛋白相互融合或早期蛋白融合有其它蛋白，能更好的激发对机体免疫系统的免疫功能。DC疫苗是HPV16/18E7抗原导入成熟树突状细胞融合而成的，有学者[8]观察，DC疫苗用于宫颈癌ⅠB、ⅡA根治术后患者，可使CD4+T细胞和CD8+T细胞增高，并产生DC疫苗抗体，无明显毒性反应。DNA疫苗常采用病毒载体或其他载体携带HPV早期基历，大多进行到临床试验阶段。RNA疫苗具有RNA复制子可自我复制，RNA疫苗的临床研究目前还未见报道[26]。

总之，宫颈癌的研究在目前已经取得重大进展。随着新技术、新医疗设备的出现，宫颈癌多方面、有计划、有目的地进行术前、术后综合治疗是研究的重点，而病因分子生物学研究、宫颈癌瘤苗的研制、基因工程的发展等领域也是未来关于宫颈癌研究的重点。

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