化疗联合过继免疫细胞治疗晚期非小细胞肺癌的临床研究

徐永茂 徐冬云 张南征 陈复兴 刘军权

肺癌是目前在全球范围内发病率及死亡率均居于首位的恶性肿瘤,并有逐年上升的趋势。由于我国仍处于发展中国家,大多数患者就诊时往往已是中晚期,失去手术机会,随着分子生物学及肿瘤免疫研究进展,除了传统的手术、放射治疗、化疗,近年来随着分子生物学和免疫学理论及科研技术的发展,免疫治疗再次引起了关注,并逐渐成为肿瘤综合治疗的 1个重要组成部分。为了提高晚期非小细胞肺癌患者的临床疗效,延长生存期,改善患者的生活质量,自 2004年 1月～2009年 7月,我科采用 NP方案联合自体外周血单核细胞培养的 CIK(cytokine-induced killers)细胞与树突状细胞(dendritic cells,DC)过继免疫治疗 38例晚期非小细胞肺癌患者,现报告如下。

1 资料与方法

1.1 入组标准

经病理学或细胞学检查证实的(国际抗癌联盟1997年分期标准)Ⅲ、Ⅳ期 NSCLC患者,卡氏评分≥70分,之前未行抗癌治疗,血常规及肝肾功能均正常,无严重心肝肾疾病。根据患者临床表现与体格检查、胸部和脑部 CT或 MRI检查、腹盆腔彩超或 CT或 MRI检查、骨 ECT检查结果进行临床分期。

1.2 一般资料

可评价的 78例中男性 57例,女性 21例,年龄 47～75岁,平均 59.6岁,鳞癌 34例 、腺癌 38例,大细胞癌 6例。其中Ⅲ期 24例,Ⅳ期 54例,随机分为研究组38例与对照组 40例,治疗前常规行胸部 CT、心电图、血常规及肝肾功能检查。所有接受过继免疫治疗患者,治疗前均明确告知过继免疫细胞治疗的优点和不足,患者或家属签署知情者同意书,并报医院伦理委员会批准。

1.3 主要仪器与主要试剂、CIK细胞与 DC的制备

Foma311二氧化碳培养箱,Foma1205生物安全柜,COULTER公司 XL流式细胞仪,CS-3000PLUS血细胞分离仪;HumanTH 1/TH2 cytokine Kit由 BD公司提供。

1.3.1 CIK细胞制备方法 抽患者晨起后外周血 200 m l,分离血浆备用,再吸出富含白细胞层的细胞约 10 m l,悬浮于等量患者自身的血浆中,淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞。剩余红细胞用生理盐水补充至原体积后回输给患者。PBS洗涤,将细胞按 2×109个/L数量悬浮于 RPMI 1640完全培养中,加至经抗 CD3单抗包被的 6孔细胞培养板,每孔 6 ml,加入终含量为50 kU/L rIL-2和 50 kU/L IFN-γ,置于 37℃ 50ml/L的 CO2条件下培养,培养 7天后,经细菌和霉菌培养阴性后再收集细胞,无菌生理盐水洗 3次,将细胞悬浮于自身的血浆中,加入 2×104U rIL-2,终细胞数为(1.3×109～1.6×109)个。静脉回输时配制成 150ml的细胞悬液,用输血器 1 h内输入。

1.3.2 DC的体外培养方法 抽患者晨起后外周血200m l,先离心分离出血浆备用,再吸出富含白细胞层的细胞约5 ml,悬浮于等量患者自身血浆中,用淋巴细胞分离液分离收集单个核细胞。剩余红细胞用生理盐水补充至原体积后回输给患者。单个核细胞用无菌生理盐水洗涤 3次,用 RPMI 1640完全培养基将细胞配成 2×109/L,加入 6孔板细胞培养板中,每孔 5 ml,置37℃、5%CO2培养箱中孵育 2 h。再用预热的培养基轻洗培养板 2次,即获贴壁的单个核细胞,每孔加入完全培养液(含 200μg/L rhGM-CSF和 50μg/L rhIL-4)3m l。每 2天半量换培养液(含 200μg/L rhGM-CSF和50μg/L rhIL-4),在培养第 9d的树突状细胞中加入rhTNF-α至 10μg/L,15 h后收集 DC细胞进行临床腋窝淋巴结附近皮下注射。

1.4 方法

研究组:采用 NP方案,NVB(国产长春瑞宾)25 mg/m2,静脉推注,第 1、8天 ;DDP每天 25 mg/m2,静脉点滴,第 1～3天,每 3～4周为 1个周期,第 2个周期化疗结束 2周血像恢复正常后,抽外周血,分离单核细胞行 CIK细胞与 DC培养,1周后回输,每周 2次,共4～5周为 1个周期。2个周期化疗与 1个周期的过继免疫治疗为 1个疗程,治疗 2个疗程后开始评价疗效。化疗期间及时复查血常规,酌情应用重组人粒细胞刺激因子升白细胞。

对照组:化疗方法同研究组。

1.5 疗效及毒性的评价

按 RECIST实体瘤的近期疗效标准[1]分为完全缓解(CR)、部分缓解 (PR)、稳定(SD)、进展(PD)4级,治疗结束 1个月后进行疗效评价。疾病进展时间(TTP)是指从治疗开始至病灶出现进展的时间。疗效为 CR和 PR的病例需继续进行治疗,PD的病例停止研究。按照 WHO统一标准评价毒性[2]。

1.6 观察指标

生活质量变化;记录患者症状及体征的变化,采用kamofsky计分方法判断治疗前及治疗后的变化。

对治疗前后的 T细胞亚群进行检测。

1.7 统计学方法

疗效采用非参数的秩和检验,研究组与对照组治疗的生活质量对比采用非参数的 χ2检验,计量资料以均数 ±标准差表示±s,组间差异采用 t检验。

2 结果

2.1 临床疗效

两组均无 CR病例,研究组中 PR 25例、SD 9例、PD 4例 ,有效率(RR=CR+PR)为 65.7%;对照组中PR 16例 、SD 15例、PD 9例 ,有效率为 40.0%,两组有效率比较差异有统计学意义(P＜0.05,χ2=4.22)。两组患者均获得随访,研究组 TTP为 5.3个月、中位生存期 (MST)为 11.9个月(95%CI 6.5～15.6个月);对照组 TTP为 4.6个月、MST为 10.4个月(95%CI4.5～12.1个月),见表 1。

表1 两组患者疗效及生存率比较(例)

研究组与对照组 1、2年生存率分别为 39.4%、14.2%和 35.3%、12.6%,两组比较无显著性差异(P=0.65)。

2.2 不良反应

骨髓抑制和胃肠道反应是主要的不良反应,两组白细胞下降发生率分别为 81.5%(31/38)和 80.0%(32/40),以Ⅰ ～Ⅱ度白细胞减少为主,应用瑞血新(G-CSF)后均能完成治疗。虽然预先应用了止吐药物,消化道反应的发生率仍较高,主要为食欲下降、恶心,少数有一过性呕吐,两组胃肠道反应发生率分别为76.3%(29/38)和 75.0%(30/40),以Ⅰ ～Ⅱ度胃肠道反应,主要表现为恶心、呕吐(可控制)。

2.3 生活质量变化

生活质量以 kamofsky评分标准计算,凡在治疗后kamofsky评分提高超过 10分者为改善,而下降超过10分者为恶化,提高或下降少于 10分者为稳定。kamofsky评分总提高率为改善 +稳定。研究组中改善24例,稳定 10例,进展 4例。对照组中改善 15例,稳定 13例,进展 12例。研究组与对照组治疗后 kamofsky评分总提高率分别为 89.4%与 70.0%,2组比较有显著性差异(χ2=4.56,P＜0.05)。

2.4 T细胞亚群变化

两组治疗前后 T细胞亚群检测结果见表 2。

表2 2组治疗前后T细胞亚群的比较±s,%)

表2 2组治疗前后T细胞亚群的比较±s,%)

★为与研究组治疗前比较,P＜0.05;▲为与对照组治疗前比较,P＜0.05

组别 例数 CD 3+ CD 4+ CD 8+ CD 4+/CD 8+研究组治疗前 1周 38 53.48±6.87 31.09±6.59 29.49±3.45 0.99±0.36治疗后 1个月 38 63.46±6.19★ 36.43±4.51★ 26.12±4.21 1.64±0.35★对照组治疗前 1周 40 51.51±6.22 32.40±5.31 27.70±6.12 1.08±0.41治疗后 1个月 40 54.28±6.31 33.52±4.44▲ 26.72±5.36 1.11±0.37▲

3 讨论

过去肺癌的化疗治疗效果一直不理想,晚期非小细胞肺癌的中位生存期仅 4～6个月,近年来随着长春瑞滨等新药进入临床使用,使晚期非小细胞肺癌的疗效有较大的提高。长春瑞滨是第 3代半合成的长春生物碱,其作用机制是通过阻止微管蛋白聚合形成微管和诱导微管解聚,使纺锺体不能形成,细胞停止于有丝分裂中期,从而抑制肿瘤的增殖[3],药代动力学研究显示长春瑞滨血浆清除率高,分布容积大,半衰期长,故广泛分布全身,该药在肝脏浓度最高,其次为肺,与顺铂有协同作用[4,5]。

肺癌的患者常呈现免疫功能抑制,免疫功能愈低者,还发生“免疫漂移”(immune shift)改变[6,7],即细胞免疫功能下降,体液免疫功能增强,机体的抗肿瘤免疫受到严重干扰[8];T细胞亚群是构成机体免疫防御的重要因素,两个主要亚群,即辅助性 T细胞(Th)CD4+和抑制性细胞(Ts)CD8+。机体内的免疫平衡主要由这两类细胞相互间影响来维持。CD 4+T细胞具有调节免疫反应的活性,辅助 B细胞产生抗体,分泌细胞因子的作用,而 CD8+则有免疫抑制和细胞毒性作用[7]。CD4+下降或 CD8+升高均可使两者比例失调,导致机体免疫功能缺陷。国内外很多研究结果表明,多种肿瘤患者有 T细胞亚群状态异常和比例失调,其CD4+/CD8+比值的降低与病变程度相关,往往提示患者的细胞免疫功能处于抑制状态,对识别和杀伤突变细胞的能力下降,从而有利于肿瘤的生长和转移。

CIK细胞兼有 T淋巴细胞强大的抗瘤活性与 NK细胞的非主要组织相容性复合物(MHC)限制性杀瘤特点,对某些肿瘤细胞杀伤活性可以达到 84.7%[9],DC是人体内最有效的专职的抗原提呈细胞。成熟的DC可通过 MHC-I、MHC-II类及 CD1分子途径提呈肿瘤抗原,有效的启动抗肿瘤细胞免疫,并能分泌 Th1型细胞因子 IL-2和 TI-12,起到激活 T细胞应答的作用。DC与 CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分,前者识别病原、激活适应性免疫系统,后者通过 MHC非限制性方式杀伤肿瘤细胞,两者联合形成了抗肿瘤免疫反应体系了 1个高效的免疫反应完成。培养的 CIK细胞发挥杀伤作用的机制主要有:释放具有细胞毒性的细胞质颗粒物杀伤靶细胞;产生大量的炎性细胞因子直接或间接杀伤肿瘤细胞;表达 Fasl,诱导肿瘤细胞凋亡。培养的DC能够通过共刺激分子与细胞因子,促进CIK细胞的杀伤活性;还能通过刺激抗原特异性 T细胞增殖,增加抗肿瘤效应。从两组的治疗前后的 T细胞亚群的检测结果,研究组的治疗后的 CD3+、CD4+、CD4+/CD8+均明显高于治疗前,研究组治疗后的CD4+、CD4+/CD8+也明显高于对照组的治疗后。

单纯的化疗虽能有效地使肿瘤缩小,并能改善症状,延长生存期,但随着抗肿瘤药物的广泛使用,耐药性成为临床肿瘤化疗失败最常见和最难克服的问题之一,而且化疗实际上并不能完全杀伤所有的肿瘤细胞,尤其是肿瘤干细胞,化疗对肿瘤细胞的杀伤呈一级杀伤,而免疫细胞对肿瘤细胞呈 0级杀伤,因此被化疗杀伤后残存的癌细胞需要患者自身的免疫细胞来清除,但对于晚期肺癌患者,本身的免疫功能低下,而经过化疗后患者的细胞免疫功能进一步低下,此时每周 2次回输的 CIK细胞与 DC,使患者细胞免疫功能得以回复与提高,从而进一步杀伤或清除化疗后那些残存的癌细胞,来巩固并提高效果。

本研究组近期有效率(65.7%)明显高于对照组(40.0%),虽然研究组的 TTP(5.3个月)、MST(11.9个月)高于对照组的 4.6个月和 10.4个月,以及研究组 1、2年生存率(39.4%和 14.2%)分别高于对照组(35.3%和 12.6%),但两组比较均无显著性差异。而研究组的治疗后患者的细胞免疫功能改善明显高于对照组,研究组生存质量的提高也明显高于对照组,患者的生活质量提高,可以增强患者抗癌的信心,激发性自身的免疫功能,从而使患者有更好的依从性。

通过以上本研究结果分析提示,对于中晚期的非小细胞肺癌,采用化疗联合培养的 CIK细胞与树突状细胞过继免疫抗癌治疗,可以取得较好的临床疗效,提高患者免疫功能,改善患者的生存质量,可以延缓患者的生存期,是 1个值得推广的治疗方法。

[1] 孙 燕,周际昌.临床肿瘤内科手册〔M〕.北京:人民卫生出版社,2006:106～112.

[2] 孙 燕.内科肿瘤学〔M〕.北京:人民卫生出版社,2001:994～997.

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[4] 朱 凡.盖诺联合顺铂治疗中晚期非小细胞肺癌 32例分析〔J〕.苏州大学学报(医学报),2004,24(1):89.

[5] 管忠震.肿瘤临床化疗的进展〔J〕.实用肿瘤杂志,2001,16(5):292.

[6] 李 振,许德顺,王化洲,等.恶性肿瘤的化学治疗与免疫治疗[M].北京:人民卫生出版社,1993:176.

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