肺癌组织中微血管的研究进展

王欢元综述 匡裕康审校

肺癌是全球最常见的恶性肿瘤之一，大约占肿瘤总的死亡人数的17%[1]。近年来尽管肺癌的诊断和治疗取得一定的进展，但其5年总体生存率仍低于15%[2]，所以预防和早期诊断是提高肺癌患者存活率的关键[3]。研究表明，肿瘤内微血管计数的高低与肺癌的发生发展、组织类型及生存率有关。肿瘤内微血管形成机制和抗血管生成治疗肺癌成为研究热点，现对肿瘤内微血管的研究进展综述如下。

1 肿瘤内微血管形成

1.1 肿瘤内微血管形成定义

肿瘤内微血管形成是指肿瘤细胞诱导的微血管生长及肿瘤中血液循环建立的过程，其过程包括两个阶段：血管发生和血管生成。血管发生是指胚胎时期中胚层细胞分化形成内细胞的前身即成血管细胞，从而构成胚胎的原始血管系统。血管生成是指源于已存在的毛细血管和毛细血管后微静脉的新的毛细血管性血管的生长。肿瘤内微血管形成过程主要步骤包括：① 血管内皮及外膜细胞的激活；② 膜基质的降解；③ 内皮细胞的迁移、增生、分化；④ 新生毛血管的成熟器官化构建。

1.2 肿瘤生长与血管关系

自从1971年Folkman博士首先提出了肿瘤生长依赖血管形成的概念，并提出抗肿瘤新生血管形成的技术可作为未来肿瘤治疗的方向以来，许多学者经过大量研究进一步证实了新生血管形成与肿瘤发生发展的关系。早期动物实验发现，将肿瘤细胞团混悬于眼前房中，因前房中无血管形成，所以肿瘤体积始终保持在1 mm3左右，可以维持很长一段时间，但肿瘤仍然保持存活；然而，一旦将这些肿瘤移植到虹膜后，新生血管迅速形成，肿瘤生长迅速，在2周内可增加至原大小的1 600倍。而80年代后，人们通过血管抑制剂研究证实肿瘤生长依赖血管的生成，如Millauer等[4]使用逆转录病毒将突变的位点缺陷VEGF受体FLK-1转导至脑胶质瘤中，结果肿瘤的血管形成受到抑制，肿瘤生长亦受到明显抑制。

1.3 目前常用的检测方法

肿瘤内血管生长因子的检测:目前测定血管生成因子反映肿瘤内血管生成能力是肿瘤微血管研究的热点。自从1989年Gospodarowicz等发现血管内皮生长因子(Vascular ednothelial growth factor，VEGF)以来，许多学者就对它进行了一系列的研究，认为VEGF在血管新生中起重要作用[5]，VEGF的表达水平反映了肿瘤内血管内皮细胞增殖、迁移和血管构建水平。近年来许多学者通过PCR、ELISA、免疫组织化学SABC染色法、免疫组化(S-P)法等检测VEGF在肺癌组织中的表达发现，肺癌组织中VEGF阳性表达与肺癌的发生发展、组织学类型、生存率具相关性，但VEGF是1个基因家族，包括PLGF，VEGFA、VEGFB，VEGFC、VFGFD及VEGFE，VEGF各因子与肺癌组织的其它相关性，有待进一步研究。

肿瘤内血管内皮细胞的检测： 肿瘤内血管的生成是肿瘤产生机理的重要环节，内皮细胞在新生血管发生中起关键作用。血管内皮细胞的检测也成为肿瘤微血管研究热点。过去一些学者主要采用免疫组化技术检测血管内皮细胞的黏附分子(如CD34、CD31)与肿瘤恶性程度及预后关系。近几年来，许多学者通过研究发现循环内皮细胞(circulation endothelial cells，CEC)在正常人血中数量极少，而在炎症、免疫应答、感染、肿瘤形成和心血管疾病等情况下数量明显增加。CEC的检测方法目前主要有以下几种：①Hladovec法：利用血液中各细胞成分的不同比重，用不同的离心力从血浆中分离出循环内皮细胞。本方法在循环内皮细胞研究的早期对提高CEC在临床上的应用起到了巨大的促进和推动作用，但由于存在一些缺陷在科研、临床中的运用受到限制；②Percoll密度梯度快速一步分离法：应用了密度梯度分层离心的原理，将适当浓度的密度梯度分层液加入抗凝血中，利用血液中各种细胞的不同比重进行离心分层。此法是现今科研临床中使用较广的分离CEC的方法；③免疫磁珠分离技术[6]：是通过采用包被着抗内皮细胞抗体的磁性颗粒来进行的，由于存在对操作者要求高及试剂的大量消耗，在科研临床中使用受到一定的限制；④流式细胞仪法：是在Percoll密度梯度离心法的基础上，使用流式细胞仪对分离的细胞加以检测、重选，并在此基础上对CEC进行检测，但流式细胞仪的价格高，大多数实验室都不具备，且操作复杂，限制了其临床应用。虽然CEC检测方法众多，但在外周血液中提取CEC仍存在一定问题，CEC计数技术有待进一步提高。

肿瘤内微血管密度法： 微血管密度法(microvessel density，MVD)是衡量肿瘤新生血管的重要方法，主要应用特异性抗体标记微血管，通过免疫组织化学技术染色，在高倍显微镜下观测微血管。但在高倍显微镜下微血管计数仍存在争议，Weidner等最早认为，在微血管密度最大区，取多个200倍视野的微血管记数的均数可作为微血管密度。随着学者对癌组织的进一步研究发现，在瘤组织中存在血管密集区，即“热点”区，认为该区血管密度值代表肿瘤血管生成能力，在该区取多个200倍视野的微血管记数的均数作为微血管密度。有学者[7]采用免疫组织化学技术研究微血管密度，发现肿瘤内微血管的分布是不均匀的，单采用某热区微血管密度并不能代表整个肿瘤内微血管密度，存在明显的误差，而采用多个区域多个视野微血管密度取平均值可以缩小误差，所以该技术有待进一步完善。微血管密度法与肺癌的发生发展、组织类型、生存率的相关性已有文献证实[8]，但微血管密度法与肺癌组织的其它相关性有待临床研究。

影像学成像法： 影像学成像法作为1种无创的、方便的影像学技术，可以定量反映肿瘤微血管特征及与肿瘤血管生成相关的功能性变化，目前在临床应用较多的有CT，MRI。许多学者通过对CT动态增强和灌注成像的影像学参数与肿瘤血管生长的生理参数之间相关性研究，得出CT影像参数与大部分肿瘤的生理参数具有相关性[9]。而MRI更能反映血管的结构、生理及功能的变化，已用于评价肿瘤的血管生成状态，检测肿瘤血供及血管生成的变化。新的靶向分子影像学出现，有助于探测调控血管生长、增殖的因素和途径，为分子水平上研究肿瘤血管提供了新的途径[10]。

1.4 与肺癌相关临床研究

新生微血管是肺癌组织的生长和转移所依赖的，大量的临床研究通过各种检测方法对肿瘤内微血管的检测证实，肿瘤内微血管的形成与肺癌组织的生物特性具有一定的相关性。Akin等[11]通过ELISA法对非小细胞肺癌患者血清中的VEGF的水平检测，发现血清中VEGF低水平(小于119 pg/ml)的生存率较高水平的(大于119 pg/ml)的生存率要高。Joo Hun Park等[12]通过ELISA法对早期肺癌患者的血清中血管生成素检测，认为血管生成素(Ang-1)可作为1种预测早期非小细胞肺癌患者的术后生存率和复发的潜在指标。有学者采用特异性凝集素和CD146抗体检测CEC水平，认为在肺癌转移患者中CEC水平高于无转移者，可能是1种新的预后预测指标，CEC在肺癌组织中的应用有待临床进一步研究。孙正涛等[13]采用免疫组织化学方法测定非小细胞肺癌组织中VEGF及MVD，发现VEGF表达与MVD值呈正相关性，MVD值及VEGF表达与非小细胞肺癌的TMN分期、淋巴结转移相关。

2 抗血管形成

2.1 抗血管形成机制

尽管到目前为止抗血管形成的作用机制并不很清楚，但大量研究表明人体存在1种血管新生的开关系统，即新血管生长刺激因子与抑制因子。当抑制因子的力量超过刺激因子时，血管生长就停止，甚至萎缩。从理论上可以从以下几个方面阻断血管形成：①抑制蛋白降解酶的活性，防止内皮细胞活化；②干扰血管生长因子的合成、释放及生物效应的发生；③阻止内皮细胞的迁移；④阻止内皮细胞的增殖。

2.2 目前抗血管形成的研究

2.2.1 血管生成抑制因子研究 血管生成抑制因子是干扰新生血管形成的各个阶段的一系列因子，目前研究主要集中在内源性血管生成抑制因子，主要包括血管抑素、内皮抑素、肌钙蛋白-1、色素上皮衍生因子(PEDF)、血小板反应蛋白-1(TSP-1)、烟曲霉素等，及其它相关的一些因子如血小板第四因子、趋化因子gro-β、干扰素-α，γ，白介素-12，18等。血管抑素和内皮抑素是目前研究较多的抑制因子。血管抑素是从肿瘤耐受性动物模型的血清和尿液中分离出来的与肿瘤生长相关的第1种内源性血管生成抑制因子；内皮抑素也是用类似方法从肿瘤耐受动物体液中分离出的抑制因子，两者均能强烈、特异性抑制血管内皮细胞增殖，抑制新生血管形成，其抗血管生长作用强于其它血管生长抑制因子。血管生成抑制因子的研究成为近年来的热点，寻找作用较强的血管生长抑制因子是该领域的关键，目前有几种抑制因子进入了早期临床实验，可能为治疗肿瘤提供新的途径。

2.2.2 蛋白酶抑制剂研究 蛋白酶解的作用在新生血管的形成过程中起着重要的作用，如基质金属蛋白酶(MMPs)降解基膜，促使内皮细胞进入基膜，参与新生血管的形成。而基质金属蛋白酶抑制剂能阻断这一过程，从而抑制内皮细胞的侵袭及新生血管的产生。研究证实几乎所有的MMPs抑制因子如TIMP-1，2，3都能抑制血管新生。目前，至少有6种人工合成MMP抑制剂(如BB94，BB2516，KB-R7785等)进入肿瘤治疗的临床试验。

2.2.3 基因治疗的研究 重复注射重组血管生成抑制因子能有效阻止肿瘤的血管化，并抑制肿瘤生长和转移，但存在一定的缺点：①价格较贵、不方便；②代谢快；③反复注射可能带来病毒感染。目前用于抗肿瘤血管生成基因治疗肺癌已成为该领域的热点，研究较多的主要有以下几种：① 内皮抑素基因； ②血管抑素基因；③血管内皮生长因子及其受体基因；④白介素-12及白介素-8基因；⑤野生型p53基因等。虽然近年来的研究表明，某些基因治疗肺癌的效果已得到临床研究的证实，但作用机制至今未研究透彻。

2.2.4 药物抑制剂的研究 从90年代人们发现1种具有较强的抗血管生成活性的半合成的烟曲霉素类似物开始，众多学者致力于研究药物抑制剂治疗肿瘤的效果。虽然一些药物抑制剂治疗肿瘤已在临床上证实具有一定的疗效，如博来霉素，苏拉明，及以血管内皮生长因子和血管内皮生长因子受体为靶点进行的抗血管生长治疗药物中腺病毒介导的p53基因及Bevacizumab等，但寻找高效、低毒、廉价、易得的药物抑制剂仍是该领域的关键问题。

2.3 抗血管生成与肺癌治疗的研究

肺肿瘤血管生成是1个受众多生长因子(包括血管生成因子、血管生成抑制因子、生长因子和凋亡因子等)调节的复杂的病理生理过程，而抗血管生成的机制主要抑制促血管生成因子与配体的表达和结合及相应的信号传递途径的过程。由于肺肿瘤细胞常因染色体变异造成基因组不稳定，致使常规化疗易产生耐药性；而血管内皮细胞基因表达相对稳定，突变率低，很少或不产生对化疗的耐药性等特点，加之成熟组织几乎没有新生血管生成，使抗肿瘤血管生成成为近年来的肺肿瘤治疗的研究热点。单克隆抗体贝伐单抗(Bevacizumab)是抗VEGF的重组人源化单克隆抗体，是第1个被批准用于抑制血管生长的单克隆抗体药物。于2004年3月份在美国上市后，Bevacizumab在NSCLCⅢ期临床试验中显示了较好的疗效[14]，Dansin等[15]认为Bevacizumab联合化疗用于晚期NSCLC的一线治疗有一定价值。Bevacizumab在治疗肺肿瘤临床应用中观察到了治疗后的咯血，且伴有肿瘤坏死、空洞形成。有研究表明[16]肿瘤内的空洞可能为抗血管生成治疗有效的1种特殊征象，继续治疗后肿瘤明显缩小。近年来1种新的抗肿瘤新生血管的药物—重组人血管内皮抑制素(YH-16)已进入临床试验。有学者报道其作用可能是对部分生长因子如碱性成纤维生长因子(Bfgf/FGF-2)及血管内皮生长因子(VEGF)的促血管生成作用进行了干预。穆海玉等[17]临床观察重组人血管内皮抑素(YH-16)联合化疗靶向治疗晚期非小细胞肺癌的临床疗效、毒性反应，把62例晚期非小细胞肺癌患者随机分为2组，临床研究表明血管内皮抑素联合化疗药物对晚期非小细胞肺癌具有较好的疗效，尤其在改善患者生存质量方面具有优势。黄纯等[18]临床试验认为，接种高转移肺癌细胞的小鼠经YH-16作用后，其原接种处移植瘤及肺转移灶之瘤块组织中的VEGF和微血管密度均明显降低、局部瘤体缩小、肺转移发生亦同时降低。同期临床研究亦表明[19]，YH-16联合NP方案治疗ⅢB或Ⅳ期NSCLC患者，提示YH-16联合NP治疗有可能使含铂一线甚至多线化疗失败者继续临床受益。

综上所述，肺癌的发生发展是多因素综合作用而成的，但其生长、浸润、转移离不开新生微血管。近几年来相关研究表明，肿瘤内微血管形成与肺癌组织的生物特性具有相关性，但如何参与肺癌组织的发生发展，以及在肺癌组织类型中存在哪些差异，如何提高肺癌组织中的微血管形成的检测水平等问题有待进一步研究。尽管近年来抗血管生成抑制剂在实验研究及临床适用阶段取得一定的效果，虽然很难确切评价其临床应用价值，但为临床治疗肺癌提供了新的途径。当然存在不少问题有待进一步解决，如肿瘤血管生成机制如何，对人类肺癌的疗效与实验性Lewis 肺癌的疗效是否相似，长期应用血管生成抑制剂的毒副作用，如何确定血管生成抑制剂的最佳给药时间、剂量以及联合化疗的方案等。积极而慎重地探讨研究与肺癌组织的生物特性有关的因素，提高肺癌的早期诊断率及生存率对于治疗肺癌仍具要重要意义和临床应用价值。

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