肝星状细胞主要信号转导通路与肝纤维化的关系*

汪美凤 平 键 综述 成 扬 审校

肝纤维化是由于急性或慢性肝脏损伤导致的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）在肝组织间质中过度沉积所导致的一种可逆性病理改变，是慢性肝病向肝硬化进展的共同环节。在肝纤维化发生发展过程中，肝实质细胞的损伤是肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）激活的始动环节，已证实HSC是ECM的主要来源，HSC激活并转化为肌成纤维样细胞，是肝纤维化发生发展的核心环节，许多因素参与了该过程的调控，其作用机制复杂，本文就HSC活化时主要信号通路的作用机制简述如下。

一、转化生长因子 -β1（TGF-β1）/Smad 途径

转化生长因子-β1（transforming growth factor，TGF-β1）是细胞因子TGF-β超家族成员之一，因其能促进成纤维细胞的转化生长而得名。其主要生物学作用有：抑制大多数细胞的增殖，诱导细胞分化，免疫抑制，促进ECM合成，调节胶原生成和组织修复，与器官纤维化发生发展有着密切的关系。在肝纤维化中TGF-β1主要是促进HSC合成ECM，促使HSC分泌金属蛋白酶组织抑制物，下调降解蛋白酶的合成，阻止新合成的细胞基质的分解而减少ECM的降解，从而打破ECM合成与降解的平衡，使ECM沉积增多，加速肝纤维化的发展。此外，TGF-β1还可上调由Sp1和Smad2反式作用因子介导的人类I型胶原，促进纤维化的发展[1]。Smad蛋白是已知的唯一的I型受体胞内底物，是TGF-β家族信号从受体到细胞核的胞内转导分子。TGF-β1在体内的表达主要与TGF-β/smad信号通路有关，TGF-β1活化后与细胞膜表面受体结合，激活Smads蛋白形成复合物，转入核内，与各种转录因子相结合，从而调控基因转录。Smads蛋白介导了TGF-β1的胞内信号转导。现已知至少有9种Smad蛋白，共分为三类，第一类为：受体型Smads（R-Smads），主要有Smad1、2、3、5、8，其中 Smad2 和 Smad3 介导 TGF-β 和活动素的信号，Smad1、5、8 则转导骨形态发生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信号。Smad1、5、8 及 BMP-7 相互作用，可抑制肝纤维化的形成[2]；第二类为通用型Smads co-Smads）是TGF-β必要的信号中转分子，有Smad4；第三类为抑制性Smads（I-Smads），抑制其他二类 Smads，主要有 Smad6、Smad7，Smad6抑制BMP信号转导，而Smad7则是抑制TGF-β与BMP信号转导，因此可抑制肝纤维化的形成。

TGF-β1在体内均以无活性的形式存在，被激活后可启动信号的传导，激活Smad2和Smad3羧基端4个氨基酸的保守序列（SSXS），使Smad2和Smad3与Smad4形成异源寡聚物，将TGF-β1信号从胞浆向胞核转位聚集，调控靶基因的转录活化。Smad7是TGF-β1信号转导抑制分子，可与Smad2或Smad3竞争结合TGF-β1型受体或Smad4，阻断Smad2或Smad3被磷酸化并转位至细胞核内，抑制信号的转导。当Smad7表达被抑制或R-Smads过度表达，可致TGF-β持续激活，引起肝纤维化，因而可以通过上调Smad7的表达来治疗肝纤维化。Liu等[3]研究表明用黄芪丹参提取混合物可明显抑制由TGF-β1引起的细胞损害，明显减少Smad2C-末端和Smad3连接区域的磷酸化，用黄芪丹参提取混合物疗法可下调Smad2/3/4混合物水平，但却可上调剂量依赖性Smad7的表达。Wu[4]等研究表明氧化苦参碱能有效降低实验性大鼠肝脏组织中胶原蛋白的产生和沉积，促进CCl4诱导的肝纤维化SD大鼠Smad7的表达，抑制Smad3和CREB结合蛋白（CREB-binding protein，CBP）的表达并且可调节TGF-β/Smad信号通路。Liang等[5]研究发现熊去氧胆酸也可通过抑制TGFβ1、Smad3和CBP的表达，增加Smad7的表达来作用于TGF-β/Smad通路从而发挥其抑制肝纤维化的作用。TGF-β/Smad通路中各型Smad分子之间精密合作，共同完成生理及病理状态下TGF-β的生物学效应，通过对其机制的深入研究，有希望为肝纤维化的治疗找到清晰的思路和更加有效的有针对性的治疗方法。

二、MAPK通路

细胞丝裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activatedp rotein kinase，MAPK）通路是又一个重要的细胞内信号转导通路。MAPK蛋白家族包括细胞外信号调节激酶（Extracellular regulated kinase，ERK）、ERK5、c-jun 氨基末端激酶（c-jun N-terminal kinase，JNK）和p38等4个MAPK亚族。这些MAPK亚族能被各种炎性刺激所激活，并对炎症的发生发展起重要作用，且活化的MAPK将信号转导入核内，能使多种转录因子磷酸化，随后发生一系列的细胞反应，如细胞的增殖与转化。

（一）ERK途径 ERK是HSC增殖的正性调节蛋白之一。ERK在细胞核内与主要的核靶转录因子ELK-1结合，调节细胞生长和分化。而血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）诱导的ERK细胞内信号途径是HSC活化和增殖的主要方式，Ras结合PDGF受体后激活Raf-1、MAPK kinase-1/2和 ERK-1、2。活化的 ERK转导入核内[6]，磷酸化转录因子Elk2-1和SAP，产生细胞增殖反应，这一过程可能是通过调节细胞周期蛋白D1和细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin dependent kinase，CDK）来实现。在对大鼠肝纤维化基因表达结构及关键基因的研究中发现[7]RSK和ERK都是MAPK通路的关键基因，与肝纤维化时I型胶原的表达紧密相关，siERK1显著抑制HSC的增殖，常伴随着诱导HSC的凋亡和I型胶原的减少，选择针对HSC的ERK1抑制剂作为靶向，将为肝纤维化的治疗提供新的策略。本课题组研究发现[8]丹参酚酸B通过抑制ERK信号转导，抑制HSC的激活与增殖和抑制HSC内I型胶原的产生来抑制肝纤维化的发生发展，其作用机制与其抑制ERK的磷酸化有关。

（二）JNK途径 JNK也是HSC细胞增殖的一个正性调节蛋白，多种应激刺激如细胞因子、细胞毒性药物、活性氧等都能增加HSC中JNK的活性。在静息或激活的HSC中，阻断JNK的活性可阻止HSC增殖。在大鼠肝门纤维母细胞的培养中发现[9]肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）能抵抗Erk1/2的磷酸化和血小板衍生生长因子诱导的促有丝分裂刺激，并诱导JNK1磷酸化促进凋亡细胞死亡。Kluwe等[10]对来自胆管结扎或服用CCl4的大鼠及慢性乙肝、非酒精性脂肪性肝炎病人的纤维化肝脏进行检测，测定JNK的磷酸化。结果发现在上述原因所致的纤维化肝脏中JNK的磷酸化水平急剧升高，并且主要存在于肌成纤维样细胞中。在体内，JNK 1缺乏大鼠在胆管结扎或CCl4处理后，纤维化水平降低，而JNK 2缺乏大鼠胆管结扎后纤维化水平升高，而CCl4处理后纤维化水平不变。这表明JNK各亚型及不同的造模方法对肝纤维化所起的作用不同。

（三）p38途径 与JNK和ERK对HSC的增殖作用不同，维持JNK的静止状态，能阻止HSC增殖，而阻断p38却能促进HSC增殖，这表明p38对HSC的增殖起着负性调节作用，可调节HSC产生胶原。Schindler等[11]研究显示炎症刺激可激活P38MAPK，而P38 MAPK也可以影响生物体内致炎与抗炎因素的平衡，决定炎症的进程.除此之外P38 MAPK也在细胞应激、凋亡、细胞周期和生长等多种生理和病理过程中起重要作用[12]。Wu等[13]研究表明CPU-II2（一种新型齐墩果酸衍生物）可通过p38 MAPK通路调节HSC的功能减弱肝纤维化的发展。p38的抑制剂可促进HSC增殖，提示p38的激活可抑制HSC增殖，阻断p38MAPK能部分阻止TGF-β的促纤维化作用。

三、过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）途径

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome Proliferatoractivated receptor，PPAR）属I型核激素受体超家族成员，是一类新的固醇类激素受体，可被脂肪酸及代谢产物激活，是调节脂肪细胞分化和能量代谢的关键转录因子，分为PPARα、β、γ三型。现在研究较多的是PPARγ信号途径。PPARγ具有多种生物学效应，在脂质代谢、糖代谢、抑制炎症反应、细胞分化、抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡等方面发挥重要作用。将PPARγ的特异激活剂加入到激活的HSC细胞培养液中，能抑制胶原的合成和拮抗PDGF诱导的HSC增殖、趋化和迁移，从而起到抗纤维化的作用。Bruck等发现[14]PPARγ与维甲酸受体联合与单独应用相比可显著抑制硫代乙酰胺诱导的肝纤维化，其机制可能是联合应用加强了对HSC增殖的抑制，减少促炎因子TGFβ1和TNF-α的分泌。本课题组[15～17]采用肝脏原位灌流酶消化、Nycodenz密度梯度离心法分离大鼠HSC，动态观察HSC表型变化并检测PPARγ表达水平。发现PPARγ表达水平随着HSC活化程度的增加不断下降。而激活PPARγ能抑制HSC增殖，抑制α-SMA、I型胶原和核RelA的表达，显著升高MMP2和9的活性。并能够诱导HSC凋亡，抑制抗凋亡因子Bcl-2的表达，促进促凋亡因子Bax表达。促进HSC中PPARγ的核转位/重分布，显著下调Cyclin D1基因、活化Rel A蛋白和I型TGFβ受体蛋白表达水平，升高MMP2和9的活性。因此PPARγ是维持HSC作为静止状态的表型上所必需的，PPARγ表达减少与HSC激活密切相关，而激活PPARγ通路可抑制HSC的活化，延缓肝纤维化形成，是逆转肝纤维化的新途径。

四、瘦素（leptin）受体介导的信号转导途径

瘦素是肥胖基因（obese，ob）的编码产物，主要由白色脂肪组织产生并分泌，在其他组织中如胎盘、骨骼肌、活化的HSC等也有表达。体内脂肪量、进食、胰岛素、肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等都可影响瘦素的分泌。现已知瘦素具有广泛的生物学效应，对一系列代谢过程产生影响，如胰岛素的释放、脂肪的合成和分解；它还参与免疫炎性反应、损伤修复、肿瘤生长等病理生理过程。活化的HSC参与了瘦素的合成与分泌，而瘦素也可作用于活化的HSC，促进HSC增殖并抑制它的凋亡，并可以促进肝内TGF-β1、PDGF等细胞因子的表达，增加I型前胶原的表达，减少ECM的降解，从而促进纤维化发展。瘦素主要表达于HSC，并可能通过窦内皮细胞发挥重要的促纤维化作用，瘦素在肝纤维化进展中起重要作用，尤其在肝纤维化的中晚期。所以抑制瘦素表达，可抑制HSC的活化，从而减缓肝纤维化进程。Wang等[18]发现瘦素介导的HSC和肝纤维化是通过其对枯否细胞的间接作用实现的，而这个作用很大程度上由TGF-β1介导实现。Qamar等[19]研究发现瘦素在细胞凋亡中所起的作用受大鼠的种类和引起凋亡的原因影响。对于野生型大鼠，瘦素能产生更少的凋亡更多的α-SMA，并且瘦素可避免HSC体内体外的的凋亡。瘦素的抗凋亡作用需要瘦素受体与线粒体激活作用邻近的凋亡通路的相互作用。

五、整合素（integrin）信号转导通路途径

整合素是广泛存在于动植物细胞表面的一种糖蛋白受体家族分子，是介导细胞与ECM间及细胞与细胞间的一类细胞黏附分子。它是由α、β两种亚基组成的异源二聚体，含有18种α亚基和8种β亚基。根据β亚单位的不同整合素可分为8种类型，同一类型β亚单位相同，而α亚单位不同。整合素作为细胞膜上一类肯定的受体分子，其配体主要为ECM，还包括细胞间黏附分子、血管细胞黏附分子和血清游离蛋白分子等。整合素作为HSC细胞膜上的异二聚体跨膜蛋白，它不仅将ECM与细胞连结在一起，而且将信息由细胞外传至细胞内，介导信号的传递。

整合素在正常及病变肝组织种的分布均十分的广泛，整合素在肝脏的表达方式与在其他组织细胞中不同，有些亚型在正常生理条件下并无表达，而在纤维化过程中则被诱导表达。此种作用主要由ECM受体-整合素所介导。在肝纤维化过程中各种整合素分子起着不同的作用，α1β1是胶原和LN双重受体，对HSC收缩功能至关重要，且配体与受体的亲和力受二价阳离子的调节；α2β1是一种胶原受体并可与L及FN反应；而α6β4可能与HSC收缩有关，也可以介导HSC与肝细胞相互作用。用免疫组化和RT-PCR法检测[20]发现胆管闭塞小鼠体内整合素αvβ6和ECM沉积水平上调，整合素αvβ6或ECM降解的抑制可能是未来治疗策略中具有吸引力的靶点。在体内[21]抑制整合素αvβ3可减少血管生成，加剧胆管结扎和硫代乙酰胺诱导的大鼠肝纤维化，尽管这种抗肝纤维化作用是在体外通过作用于HSC而实现的，但因其减少血管生成的同时加重了肝纤维化，所以这种血管生成抑制剂需慎用于肝纤维化病人。

六、NF-κB信号转导通路

NF-κB是一种具有转录激活功能的蛋白质，属于NF-κB/Rel蛋白家族[16]。包括 p65、p50、p52、c-Rel和 RelB 5 种NF-κB/Rel蛋白，组成同源或异源二聚体，其中p65和p50组成的异源二聚体最多见。NF-κB是调节炎症反应最为重要的转录因子，在受到氧自由基、TNF-α、IL-1、LPS及紫外线等刺激下NF-κB可被激活，并启动TNF-α、IL-1、细胞粘附分子和环氧合酶-2等基因转录，导致TNF-α、IL-1等促炎因子大量产生，引发炎症反应。这说明NF-κB的活化是抑制放射线、化疗抑制TNF诱导细胞凋亡的重要因素之一，而维生素E可通过清除氧自由基，抑制NF-κB的活化。抑制NF-κB的活化可明显增强细胞对放射线、化疗和TNF等介导的凋亡诱导作用。NF-κB还可介导抑制中枢神经系统内儿茶酚氧位甲基转移酶，而儿茶酚氧位甲基转移酶参与炎症疼痛反应，这说明NF-κB还可抑制疼痛。静止HSC向活化HSC转化时，NF-κB的结合活性增加，通过诱导纤维化因子，介导肝纤维化过程。已发现MIκBα的表达可以抑制NF-κB蛋白的表达，提高大鼠HSC对TNF-α的敏感性，通过诱导HSC的凋亡，从而抑制肝纤维化[22～23]。

七、小结

综上所述，活化HSC增殖过程中所涉及的信号转导极为复杂，这些信号通路相互联系相互作用，形成了错综复杂的信号传导网络系统，共同介导慢性肝损伤至肝纤维化的漫长病理过程。要想以单一的方式来逆转肝纤维化似乎有些困难，对于各通路中HSC的激活、产生、增殖机制，目前的研究还不够理想，只有了解其机制，找到特异性的阻断方法，才能有针对性的治疗肝纤维化，得到满意的疗效。

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