间充质干细胞治疗肝脏疾病的研究进展*

林 沪 陈黎明 施 明 王福生

间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSCs）为来源于中胚层间充质的成体干细胞，主要存在于骨髓、脐带血、脐带、胎盘、外周血及肝脏等器官间质和结缔组织中。它们具有独特的免疫调节作用、自我更新和跨胚层多向分化潜能等特点。它们能够分化为肝细胞样细胞、纤维母细胞、成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肌原细胞以及神经外胚泡等。特别是有实验证明MSCs分化成的肝细胞样的细胞，具有正常肝细胞功能，如分泌尿素和白蛋白等。所以，MSCs移植治疗肝病已成为国内外干细胞研究的热点。

一、MSCs治疗肝病进展

大量体内外研究表明，MSCs可以促进损伤肝脏修复、改善症状、提高存活率[1，2]，MSCs可以用于治疗急性肝衰竭、终末期肝病和遗传代谢性肝病。

（一）急性肝衰竭 肝衰竭的特点是短时间内大量肝细胞的坏死和肝功能的急剧恶化，既往认为，MSCs移植可以提供大量的干细胞分化为肝细胞样细胞，从而替代正常肝脏所需要的合成和代谢功能。但近期研究发现，在组织修复方面，MSCs旁分泌机制改变组织微环境比MSCs向肝细胞的转化更重要，干细胞移植治疗肝损伤受体，只是促进其肝细胞的轻微增殖替代[1]。应用MSCs移植治疗肝衰竭大鼠模型的多个实验显示[2～4]，MSCs可以分泌多种细胞因子，能够抑制肝细胞凋亡、促进肝细胞增殖及肝脏血管生成，抑制免疫细胞增殖及向肝脏迁移，能够调节肝衰竭大鼠肝脏及全身免疫炎症反应，提高大鼠生存率。实验显示[5]，MSCs移植到实验小鼠后第四周，其增殖数量仅占受体肝细胞的1%～3%，提示在短时间内治疗急性肝衰竭，MSCs分化为肝细胞不可能是主要作用。

（二）终末期肝病 在肝硬化的患者肝组织中，假小叶的形成改变了肝内的管道结构，阻碍了肝细胞和血浆的交换，使细胞治疗很困难。因此，理想的MSCs移植治疗是重建肝内管道系统，这需要移植MSCs的多向分化与增殖能力。多数动物实验证实，MSCs移植能减轻肝纤维化、改善肝功能以及不同程度转化为肝细胞[6]。MSCs治疗终末期肝病的多数临床实验显示，对患者短期治疗生活质量和肝功有一定程度改善，然而，其效果与动物实验尚有一定差距。在伊朗，4例失代偿肝硬化患者移植自身骨髓MSCs，无副作用发生，随访末生活质量评分均提高，有2例患者的终末期肝病评分模型（MELD）评分及肝功得到改善[7]。经外周静脉或门脉将自身骨髓MSCs，移植给8例MELD评分≥10的肝硬化患者（4例乙型肝炎，1例丙型肝炎，1例酒精性，2例病因不明），6月后所有患者均耐受治疗，MELD评分显著下降，白蛋白增加，肝功得到改善[8]。但MSCs移植的临床实验尚有缺陷，如病例数量较少，缺乏对照，缺乏远期疗效和安全性分析等。

（三）遗传代谢性肝病 细胞移植与基因治疗的联合应用，是目前治疗遗传代谢性肝病的热门课题，但目前仅限于动物模型研究阶段[9]。MSCs的基因修饰是将外源基因转入MSCs，不影响MSCs特性，且可产生相应的因子，从而更高效治疗各种肝病。已证实多种因子如HGF、IL-3、VIII因子、IFN-β、生长激素、CD-2等可以通过此种方法达到治疗的目的。目前已见应用干细胞成功治疗遗传代谢性疾病，包括Crigler-Najjar综合征[10]、原发性全身性淀粉样变性[11]等，尚无MSCs应用于临床的文献，但MSCs因来源广泛将可能成为最具效力的干细胞。

二、MSCs治疗肝病的机制

MSCs除了具有多向分化潜能，更重要的是在损伤肝脏旁分泌一系列营养因子，通过调节免疫减轻炎症反应、抗肝细胞凋亡、抗肝纤维化、促进内源性肝干细胞分化和刺激内源性肝细胞增殖、促进血管增生等修复肝组织。故MSCs的旁分泌机制是其治疗肝病的重要机制[12]。

（一）抗炎 MSCs在异基因移植中能长期存活并发挥正常的生物学功能，原因主要有：①独特的免疫表型：MSCs低表达MHCⅠ类分子，不表达MHCⅡ类分子、FasL和T细胞协同刺激分子B7等，故免疫原性很弱。实验证实MSCs在合适的体外分化条件下可以跨胚层分化为内胚层的肝实质细胞，并且具有移植后不发生排斥反应的特点[13]。②免疫调节作用：MSCs能够分泌可溶性细胞因子介导免疫抑制及诱导免疫耐受。通过阻断抗原递呈细胞的成熟和功能、抑制B细胞分化、降低T细胞和NK细胞的免疫应答能力，从而非特异性地抑制同种异基因淋巴细胞增殖。将包含大量因子的MSCs条件培养液，其中有胰岛素样生长因子、白细胞介素（IL）-8、肝细胞生长因子、成纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肿瘤坏死因子（TNF）、转化生长因子等，经静脉注入肝衰竭大鼠，肝脏组织学检查示，小叶旁白细胞侵润、肝细胞坏死和胆管复制均明显减少；CT检查表明，MSCs条件培养液改变了白细胞的迁移，使白细胞继发性从损伤肝脏转移，说明MSCs条件培养液可抑制免疫细胞增殖及向肝脏迁移，能够减轻损伤肝脏的炎症反应，提高了大鼠存活率[1]。除了细胞免疫反应，体液免疫反应也是肝损伤炎症反应的重要组成，控制该反应的关键是，减轻前炎性细胞因子如TNF-α和IL-1的细胞毒作用。MSCs分泌IL-1受体拮抗剂（IL-1RA），抑制前炎症细胞因子的产生，并上调抗炎细胞因子如IL-10[14]。

（二）抗凋亡 研究显示，MSCs可通过旁分泌机制分泌相关细胞因子，如基质细胞衍生因子-1、血管内皮生长因子等，抑制各种类型受体细胞凋亡，其中SDF-1/CXCR-4轴具有重要调节作用。人骨髓MSCs植入肝衰竭大鼠体内，大鼠明显降低的死亡率与凋亡肝细胞数量减少相关[1]。在急性肝损伤大鼠模型[15]，静脉灌注MSC条件培养液后，阻止了肝损伤生物标记的释放，使肝细胞凋亡减少90%，增殖期肝细胞数量增加3倍，体外实验也证实MSC条件培养液的直接抗凋亡和促进肝细胞有丝分裂。

（三）抗纤维化 大量动物及临床实验证明[7，16]，MSCs移植能抑制肝细胞内TGF-β1、平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达，减轻肝纤维化程度。MSCs移植抗肝纤维化的机制目前多数认为，MSCs通过旁分泌机制调节肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的功能，分泌抗纤维化物质如HGF直接诱导HSC凋亡，分泌IL-10和TNF-α抑制HSC增殖及基质合成[17]，移植的MSCs表达高水平的基质金属蛋白酶（matrix metallo proteinase，MMP）-9直接降解 ECM[18]等减少细胞外基质沉积、抑制肝组织纤维化的形成。但MSCs移植抗纤维化尚有争议，有实验证实[19]，MSCs移植入肝纤维化患者或小鼠体内的MSCs倾向于分化为HSC和肌纤维母细胞，发挥促肝纤维化作用。

（四）分化 研究证明，干细胞所处的微环境是其定向分化的决定因素。细胞局部的微环境包括多种细胞因子、激素、基质细胞、细胞外基质等，细胞因子的作用尤为重要，不同的细胞因子作用下MSCs可分化为不同的细胞类型。肝损伤局部微环境的改变，可产生多种细胞因子，促进和增强MSCs的分化；另一方面，MSCs在损伤肝脏可反应性分泌HGF、FGFs、TGF-β、EGF、IL-10等多种因子促进损伤肝组织修复。MSCs通过磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidyl inositol-3-kinase，PI3K）、MEK、P38、核因子（nuclear factor，NF-κB）等机制，介导EGF受体和TNF受体间的交互作用，产生HGF、EGF、FGFs等因子[20-22]。其中，由非肝实质细胞或间充质细胞分泌的HGF是诱导分化为肝细胞的关键因子，它通过与MSCs膜表面特异性受体c-Met结合，能促进多种细胞的有丝分裂。

此外，FGFs、EGF、TNF-α、IL-3、IGF、干细胞因子（stem cell factor，SCF）、制瘤素 M（oncostatin，OSM）、曲古菌素 A、内毒素、糖皮质激素、胰岛素-转铁蛋白-亚硒酸钠（insulintransferrin-sodium selenite，ITS）、尼克酰胺等也参与了MSCs向肝系的分化，与 HGF 起协同作用[23～25]。其中，HGF、FGFs在肝细胞的发育和增殖中有不可替代的作用。

（五）血管形成 理想的干细胞移植治疗是修复或重建肝内管道系统，即接近于正常肝脏功能需求的动脉、门静脉和胆道系统。MSCs具有跨胚层多向分化潜能，在合适的分化条件下，可以跨胚层分化为内胚层的肝细胞样细胞、胆管细胞和血管内皮样细胞[26]。但干细胞在肝脏管道形成中的确切作用尚有待进一步研究。肝脏再生增殖与新生血管的形成有关，而MSCs可为新生血管及其侧枝形成提供营养支持。实验证实[27，28]，IGF-1、HGF、IL6、IL8、IL11、VEGF、FGF、单核细胞化学引诱蛋白（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、骨形态形成蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）-2均促进新生血管形成和改善器官缺血状况。研究证实[29]，Notch/Jagged信号通路在MSCs向肝细胞样细胞、胆管细胞和血管内皮样细胞的分化、成熟过程中起重要作用。

三、MSCs治疗肝病的副作用

（一）致癌性 理论上，MSCs可通过直接转化、抑制抗肿瘤免疫反应和对肿瘤细胞的营养作用等导致肿瘤发生，具体机制尚不清楚。Wnt信号是生长刺激信号，可促进MSCs的增殖和分化，当Wnt信号抑制，MSCs可导致肉瘤发生[30]。

（二）免疫能力下降 MSCs非特异性地抑制同种异体淋巴细胞增殖。临床实验中，9名移值物抗宿主疾病患者经MSCs移植后，有3例出现病毒感染[31]，提示MSCs所致免疫抑制可能导致机体对病原体免疫监视的减弱。

（三）多向分化 有研究表明骨髓MSCs移植可引起钙化或向骨骼分化[32]，也可分化为成纤维细胞表型[19]，故多分化潜能的不可调控性是骨髓MSCs主要缺陷。

四、问题与展望

尽管关于MSCs的研究已取得较大进展，但临床广泛应用前尚有许多问题尚待明确。首先，进一步阐明MSCs移植治疗机制及MSCs分化机制，以利增强MSCs的定向诱导分化及保障移植的安全性；其次，明确MSCs在受体内存活、增殖及分化情况，必要时采用示踪法观察；第三，合理设计多中心随机双盲对照临床研究验证疗效，并了解移植可能发生的副作用或并发症。随着上述问题的解决，MSCs移植应用于临床治疗肝病将极具前景。

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