PCR-DGGE技术在环境微型生物群落研究中的应用

吴 利, 余育和, 冯伟松

(1.合肥师范学院生命科学系,安徽合肥230061;2.中国科学院水生生物研究所,武汉430072)

PCR-DGGE技术在环境微型生物群落研究中的应用

吴 利1, 余育和2, 冯伟松2

(1.合肥师范学院生命科学系,安徽合肥230061;2.中国科学院水生生物研究所,武汉430072)

变性梯度凝胶电泳(PCR-DGGE)具有可靠性强、重复性好、方便快捷等优点,目前被广泛地应用于环境微型生物群落多样性和动态分析。本文对PCR-DGGE技术的基本原理和流程,图谱的优化过程和图谱分析方法,及其在环境微型生物生态学中的应用进行了综述,并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。

PCR-DGGE;微型生物;群落

微型生物(microbiota)泛指需借助显微镜才能观察到或观察清楚的微小生物,主要包括细菌、真菌、单细胞藻类和原生动物,有时也包括小型的后生动物如轮形动物以及各种无脊椎动物的幼虫和幼体等。微型生物分布在生态系统中各个层次的空间里并占据着各自的生态位,彼此之间通过十分复杂的相互联系和相互作用而构成生态系统中一个特定的生物群落——微型生物群落(microbial community)[1-2]。

微型生物因个体十分微小,因此依据形态特征对微型生物进行物种鉴定是非常困难的,并且有些微型生物的物种形态鉴定甚至是不可能的,如细菌等。伴随着分子生物学技术的发展,分子指纹技术逐渐成为解决某些分类困惑的重要手段,并可能成为跨越形态鉴定而连接DNA结构与物种构成的桥梁。变性梯度凝胶电泳(denatured gradient gel electrophoresis,DGGE)是由 Fischer和Lerman于1979年最先提出的用于检测DNA突变的一种电泳技术[3]。它的分辨精度比琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳更高,可以检测到一个核苷酸水平的差异。1993年,Muyzer等[4]首先将DGGE应用到微型生物群落结构研究,并指出了这种技术在揭示自然界微型生物区系的遗传多样性具有独特的优越性。由于DGGE技术避免了分离纯化培养所造成的分析上的误差,通过指纹图谱直接再现群落结构,目前已经发展成为研究微型生物群落结构的主要分子生物学方法之一[5-6]。本文对PCR-DGGE技术的基本原理和流程,图谱的优化过程和图谱分析方法,及其在环境微型生物生态学中的应用进行了综述,并对该技术自身存在的局限性和应用前景进行了评价。

1 PCR-DGGE的基本原理与方法

1.1 PCR-DGGE基本原理

DNA分子双螺旋结构是由氢键和碱基的疏水作用共同作用的结果。温度、有机溶剂和p H等因素可以使氢键受到破坏,导致双链变性为单链。DGGE技术检测核酸序列是通过不同序列的DNA片段在各自相应的变性剂浓度下变性,发生空间构型的变化,导致电泳速度的急剧下降,最后在其相应的变性剂梯度位置停滞,经过染色后可以在凝胶上呈现为分散的条带。该技术可以分辨具有相同或相近分子量的目的片段序列差异,可以用于检测单一碱基的变化和遗传多样性以及PCR扩增DNA片段的多态性[7]。该技术首先从复杂微型生物集合中提取基因组DNA,用特异性引物(如16S rRNA基因和18S rRNA基因)进行PCR扩增,混合的PCR产物在变性剂线性梯度变化的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳,相同大小不同序列的DNA片段将停留在凝胶的不同位置,以达到分离混合 PCR产物的目的。

DGGE技术具有以下优点:1)分辨率高,能够检测出只存在单碱基差异的突变个体;2)加样量小, 1～5ng的DNA或RNA加样量就可达到清晰的电泳分离效果;3)重复性好,电泳条件如温度、时间等易于控制,可保证电泳的重现性和结果的重复性;4)操作简便、快速,可以同时检测多个样品;5)可以从凝胶中切下谱带,然后测序分析来揭示群落成员系统发育的从属关系,进一步可以用类群特异探针同群落图谱杂交,检测出特异种群的存在。DGGE技术具有以下缺陷:1)其检测的DNA片段最适长度为500bp,超出此范围的片段DGGE分辨率会下降;2)PCR扩增所需 GC碱基对含量至少达40bp; 3)如果电泳的条件不适宜,不能保证将有一定序列差异的DNA片段完全分开,会出现序列不同的DNA迁移在同一位置的现象。DGGE的条带数不能完全精确地反映被分析的混合物中不同序列的数量。有时一条DGGE带可能代表几种物种,从而导致自然群落中生物的数量被低估,或者可能不同的几条DGGE带代表同一物种,从而导致高估自然群落中生物的数量;4)数量较少的物种DNA可能得不到PCR扩增。

1.2 PCR-DGGE流程

PCR-DGGE的基本流程是:(1)首先从各种不同环境中取得环境样品;(2)进行环境样品宏基因组DNA的提取及纯化;(3)通过聚合酶连锁反应(PCR)将提取的宏基因组DNA中的特定序列如16S rDNA和18S rDNA进行扩增;(4)进行预实验,优化DGGE条件;(5)制胶;(6)扩增产物利用DGGE进行分离;(7)DGGE图谱分析;(8)对DGGE条带进行测序并鉴定分析,鉴定群落成员。

2 PCR-DGGE图谱的系统优化

利用DGGE分析复杂环境样品时,获得高分辨率的图谱是重要的前提条件。影响DGGE分辨率的因素很多。如DNA提取效果、PCR扩增效果、电泳时间、电泳温度、凝胶浓度、变性剂梯度、染色方法等。在DGGE的操作过程的每一个环节都会对后续分析产生影响并导致误差的产生,因此必须对全部环节进行优化才能获得DGGE图谱的最大分辨率。

2.1 环境宏基因组DNA提取方法

对环境样品宏基因组DNA直接提取可以保证所获得的样品具有一定的代表性,克服了传统微型生物培养技术的局限性。环境样品宏基因组DNA的提取和纯化是PCR-DGGE指纹技术的前提。在提取环境样品宏基因组DNA时,同时被提取的还有样品中存在的杂质,这些杂质会影响PCR过程中酶的活性,从而影响实验结果的真实性及稳定性,因此获得较高纯度的环境样品宏基因组DNA是至关重要的。目前主要是采用物理或化学方法将细胞中的DNA游离释放出来,然后进行直接提取。物理方法包括研磨、机械破碎、超声波破碎法等,而化学法包括SDS裂解和溶菌酶法等[8]。

2.2 PCR扩增优化

PCR扩增是DGGE技术中至关重要的步骤,在PCR扩增中,引物的选择、扩增程序和PCR产物的质量都会造成群落结构的分析偏差。在分析微型生物群落时,通常采用原核生物16S rDNA或真核生物18S rDNA中的保守区作为引物进行PCR反应。然而在分析不同样品时通常需要选择适宜的引物,否则达不到预期的效果。扩增片段大小对DGGE分析影响也较大,200bp左右的片段分离条带数最多、效果较好,但是在系统发育分析中往往是分类信息缺乏。450～500bp左右片段的分类信息相对更为丰富。常规的DGGE电泳技术对于长度超过500bp的DNA片段的序列变化情况,只能有50%的检出率[9]。应用“GC夹板”技术可以提高检出率[9-10]。由于DNA分子中的 G、C碱基对要比A、T碱基对结合得牢固,因此G、C含量高的区域具有较高的解链温度。基于这一原理,通常在DNA片段上连接一段长度为30～50bp富含 GC的核苷酸序列(GC夹板或GC发卡结构)附加到双链的一端以形成一个人工高温解链区,这样可以分辨相差一个碱基的序列。罗海峰等[11]在研究土壤微型生物多样性中用到 GC发卡结构的效应,结果表明,含GC发卡结构的PCR扩增产物在DGGE中能够得到很好的分离,而无GC发卡结构的PCR产物则不能在DGGE中获得较好分离。

2.3 变性剂梯度的确定

聚丙烯酰胺凝胶浓度的确定取决于基因片段的大小,片段大小在200bp左右时,可用8%的凝胶,当片段在500bp时,可用6%的凝胶。根据变性剂梯度方向的不同,DGGE可分为:(1)垂直DGGE,主要用于试验决定分离野生型和突变型的最佳变性剂梯度范围;(2)平行DGGE,其变性剂的梯度同电场的方向平行,主要用于解链范围明确的DNA片段的检测。变性剂的选择是取决于环境样品的Tm值,复杂环境样品Tm差异较大,要分辨较多环境样品,变性剂梯度范围则较宽。一般用垂直变性梯度实验来选择所研究片段的解链性质、变性剂浓度梯度。采用垂直变性梯度电泳后经染色处理,片段经凝胶成像后呈现出一条清晰的“S”型曲线,变性剂梯度范围应选在垂直实验曲线斜率较大的部分[7-8]。

2.4 电泳温度及时间的确定

电泳的温度低于待测DNA片段解链区域Tm值。对绝大多数天然的DNA片段50～65°C比较适合。但是对于复杂的未知环境样品来说,解链温度通常是比较复杂的,因此通常是在60℃左右进行优化。在水平电泳分析样品之前,先要优化确定电泳所用的时间。一般采用时间间歇的方法,即每隔一定时间加一次样品,从而使样品的电泳时间有一个梯度。根据这个结果确定最佳的电泳时间[7-8]。电泳时间往往受样品的片段大小、凝胶浓度、变性剂梯度、电泳时的电压等因素的影响。因此如果改变了这些参数,电泳时间必须重新优化和调整。

2.5 染色方法的选择

DGGE电泳后需要进行核酸染色才能呈现出指纹图谱,最常用的是溴化乙锭(Ethidium bromide,EB)染色法、荧光染料染色法(SYBR Gold和SYBR Green I)[12]和银染法。相比而言,溴化乙锭价格便宜,但毒性较大,且灵敏度不高;银染法灵敏度最高,但无法进行后续的杂交分析,但是银染法仍然是比较完善的染色方法,并被研究者广泛使用;荧光染料染色法背景色低,可以更好地显示DGGE条带,但是价格较高。通常可以根据研究的目和实际情况选择适宜的染色方法。

2.6 DGGE图谱的统计分析

应用统计学方法对DGGE图谱进行归纳总结,从而解释环境微型生物群落结构和演替规律。目前可运用凝胶分析软件如Quantity One对DGGE图谱中的条带位置和强度进行简单分析。但是条带的强度不能代表细菌的数量,只能根据条带的强度表示相对的趋势。排序(Ordination)和分类(Classification)是群落生态学中两种主要的多变量分析方法,因此可以应用多元变量的统计学方法分析DGGE图谱。目前,对DGGE图谱分析应用较多的是非加权算术平均法(UPGMA)[13-18],多维尺度分析(Multidimensional scaling,MDS)[17,19-20]、主成分 分 析 (Principal - component analysis, PCA)[17,21-22]和典型对应分析(canonical correspondence analysis,CCA)[23-27]。

2.7 DGGE图谱的核酸序列分析

为了解微型生物群落结构和系统进化关系,通常需要切取DGGE图谱中的优势条带,获得序列信息。一个条带经常含有多种序列,所以在切取条带重新扩增后需要对PCR产物进行克隆,然后测序。从一个切取条带的克隆文库中随机挑选一些克隆,然后用带GC夹的引物扩增,每个克隆的PCR产物再进行DGGE分析,检查与切取条带的迁移位置是否一致,选择一致迁移位置的克隆进行测序分析。如果条带过于复杂,则需要进一步提高DGGE的分离效果。也可以选择种属特异引物选择性扩增样品[28-29]。在获得条带的序列信息后在 GenBank中进行比对分析,搜索最相似的序列。将全部序列比对齐后构建系统进化树,得到待测样品的系统进化或分类信息。

3 PCR-DGGE在环境微型生物生态学中的应用

PCR-DGGE技术解决了传统方法的片面性,在分析各种环境微型生物群落多样性和动态性方面得到了广泛应用。Eichner等[30]和 Watanabe等[31]运用DGGE研究了活性污泥中细菌群落结构的多样性。Simpson等[32]和Zoetendal等[33]运用DGGE研究了人体和动物肠道微型生物群落的多样性。Ferris等[34]运用DGGE对美国黄石公园一温泉中不同温度菌藻系中的细菌多样性进行比较,发现从相同温度采集的样品的DGGE条带相同,而从不同温度得到的样品的DGGE条带差异很大。赵兴青等[35]采用PCR-DGGE比较南京市玄武湖、莫愁湖和太湖不同位置的表层沉积物微型生物群落结构,研究结果表明玄武湖和莫愁湖表层沉积物中大约有20种优势菌群,且同一湖泊不同采样点DGGE图谱的差异性不大,细菌群落结构具有较高的相似性,而与太湖沉积物样品的DGGE条带数目和位置具有明显差异性,且太湖不同采样点的DGGE图谱也有较大的差异性。Foti等[36]运用PCR-DGGE研究了俄罗斯阿尔泰边疆区的库伦达草原的四个不同盐量梯度碱湖中硫酸盐还原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB)的多样性。Teske等[37]采用 PCRDGGE法分析了硫酸盐还原菌时空分布的变化。Celussi与Cataletto[21]运用PCR-DGGE对北部亚得里亚海的里雅斯特湾浮游细菌群落结构的多样性进行了每月的定期检测。王峰等[38]应用 PCRDGGE分析了传统城市污水处理工艺和化学生物絮凝处理工艺反应池活性污泥样品在菌群结构上的差别。Sandaa等[39]研究了不同污染程度土壤中的重金属对古菌群落的影响。Da Mota等[40]用 PCR -DGGE研究增施石灰对玉米根际土壤和非根际土壤微型生物群落结构的影响。李友发等[41]利用PCR-DGGE对福建省6个不同地区12个取样点的稻田土壤进行细菌群落结构分析。王君等[42]采用PCR-DGGE对高温油藏的微型生物群落进行了多样性分析,并将得到的信息用于指导油藏微型生物的分离。Fujimoto等[43]和Zijinge等[44]同时将DGGE作为一种新的研究方法应用于口腔微型生物的研究。目前,绝大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的16S rRNA基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样性。近年来,许多研究者运用真核生物的通用引物扩增18S rRNA基因研究真核生物群落遗传多样性。龙良鲲等[45]分别从丛枝菌根(AM)真菌的单孢、宿主植物根系及土壤样品中提取DNA,对AM真菌的18S rDNA中NS31/ Glol区进行Nested-PCR特异性扩增,表明Nested-PCR能很好地以微量DNA为模板扩增出目标产物;对扩增产物进行DGGE电泳,3种样品表现出不同的DGGE指纹图谱特征。Díez等[20]用DGGE研究海洋中微微型真核生物群落的多样性,真核生物特异性引物PCR扩增18S rDNA片段的DGGE指纹用于比较不同时间从地中海西南部一观测站采集不同深度样品的微微型真核生物的多样性。PCR扩增18S rDNA片段的DGGE被用来研究海岸沙丘区固沙植物的真菌感染,切下DGGE带与真菌分离物的DNA序列比较揭示了未知的多样性[46]。用18S rDNA片段的DGGE比较荷兰浅淡水湖系不同水体真核生物的多样性[47]。上述研究均是运用PCR-DGGE技术分别研究原核生物和真核生物的遗传多样性,至今只有少数报道运用PCR-DGGE研究浮游生物群落(包括原核生物和真核生物)的遗传多样性。Savin等[48]首次运用PCR-DGGE研究了浮游生物群落遗传多样性的变化。此后,PCR-DGGE被运用于研究不同环境条件下(如湖泊[17,23,24,27]、水库[25]、室内模拟生态系统[26]、人工模拟试验湖[13]、废水处理厂[16])浮游生物群落遗传多样性,并探讨了浮游生物群落遗传多样性与物种组成及理化因子之间的关系。

4 PCR-DGGE在微型生物生态学中的应用前景

PCR-DGGE除具有可靠、可重复、快速、容易操作等特点外,还能直接显示微型生物群落中优势组成成分,并可以同时对多个环境样品进行分析从而使之非常适合调查环境微型生物群落的时空变化,而且可以通过序列分析鉴定群落成员,因而该技术已发展成为分析复杂环境中微型生物群落的多样性及动态变化的主要指纹技术。目前,利用功能基因作为分子标记物研究代谢活性已成为分子生态学的一个新方向[49-51],可利用PCR-DGGE分析环境微型生物群落功能菌的功能基因,如可容性甲烷加单氧酶羟化酶基因(mmoX)和氨加单氧酶a-亚单位基因(amoA)从而反映功能菌的变化。为减少各种不同技术的偏见和限制性,结合PCR-DGGE和其它分子指纹技术更实际地揭示微型生物群落的结构和功能。

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Application of PCR-DGGE in Study of Microbial Community

WU Li1, YU Yu-he2, FENG Wei-song2

(1.Department of L if e Sciences,Hef ei N ormal University,Hef ei230061,China;2.Key L aboratory of Biodiversity and Conservation of A quatic Organisms,Institute ofHy drobiology, Chinese Academy of Sciences,W uhan430072,China)

PCR-denaturing gradient gel electrophoresis(PCR-DGGE)has the advantages of high reliability, good repetition,and easy operation.Currently,it has been widely used in the study of diversity and dynamics of microbial communities.This paper introduces the principle and procedure of PCR-DGGE,discusses the optimization and statistical analysis of PCR-DGGE profile,reviews its application in the study of environmental microbial ecology,and analyzes its limitations and potential application.

PCR-DGGE;microbiota;community

Q145

B

1674-2273(2010)06-0103-06

2010-06-02

吴利(1981-),女,安徽凤台人,合肥师范学院生命科学系教师,理学博士,主要从事浮游生物生态学研究。