猪链球菌 2型毒力相关因子研究进展

朱 僧,孙长江,雷连成,韩文瑜

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

猪链球菌 2型(Streptococcus suis serotype 2,SS2)被认为是猪链球菌 35个血清型(1～34型和 1/2型)中分布最广致病性最强的一个血清型,可以引起断奶仔猪的脑膜炎、支气管肺炎、败血症、关节炎等,而且 SS2是可以引起人类感染的病原体,特别是那些与猪或者猪肉制品紧密接触的人群[1]。SS2感染人之后可以引起人的化脓性关节炎、脑膜炎、心内膜炎和中毒性休克综合症等[2]。中国自 1958年首次报道猪链球菌病以来,该病的发生呈上升趋势,而且危害日趋严重。在 1998年和 2005年两次爆发猪链球菌病的地方性流行,引起近百人感染猪链球菌,造成 53人死亡[3]。由此可见,SS2不仅给养猪业造成巨大的经济损失,也给人类的健康带来严重的威胁,引起了国内外学者的广泛关注。

当前,SS2的控制和消灭仍然具有很大的困难。为了建立该病快速有效的诊断方法以及可靠的防治措施,科研工作者们对其致病机理进行了深入的研究,发现了多种与 SS2致病性相关的毒力因子,例如荚膜多糖、溶菌酶释放蛋白、胞外因子、溶血素等。随着研究的逐渐深入,发现了更多与 SS2毒力相关的蛋白质和基因序列。本研究就 SS2主要的毒力因子进行综述,为 SS2的深入研究提供科学依据和参考。

1 多糖类

荚膜多糖(capsular polysaccharide,CPS)是唯一被证实的毒力因子,CPS由鼠李糖、半乳糖、葡萄糖、N-乙酰葡萄糖胺和唾液酸组成[4]。CPS对 SS2的侵袭力有决定性作用,可以在未免疫动物体内产生具有抗吞噬活性功能的抗体,保护细菌不被体内的巨噬细胞吞噬。Charland等[5]研究发现,缺失CPS可以明显提高菌株的疏水性和小鼠巨噬细胞及猪单核细胞的吞噬作用。Smith等[6]通过插入突变构建了 2株荚膜抗原的表型突变菌株。与 SS2野生型菌株相比,无荚膜的菌株对体外的猪肺巨噬细胞的摄入很敏感。实验还证明,这 2个突变菌株在鼠和猪的感染模型上都是无毒力的。但由于无毒力菌株同样具有荚膜的存在,表明存在着其他的毒力因子导致 2种菌株之间的毒力差异。另外,根据荚膜多糖的差异性,用协同凝集实验等方法,可以将猪链球菌分为 35个血清型:1～34型及 1/2型。

2 蛋白类

2.1 溶菌酶释放蛋白(MRP)

溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,MRP)是一种胞壁蛋白,具有良好的免疫原性。目前已发现 MRP类似物(MRP*和 MRPS)的存在。曾巧英等[7]以 Hep2细胞为研究模型,结果发现 MRP可以诱导细胞发生 2种典型的形态学变化:诱导细胞融合成多核细胞,然后巨噬细胞发生凋亡;诱导单个细胞凋亡。投射电镜和流式细胞仪分析证明 MRP具有诱导上皮细胞凋亡的功能(凋亡率达到18%)。MRP还具有粘附的作用,含有 MRP的菌株可以抵抗巨噬细胞的吞噬并且粘附到上皮细胞上,但是如果 56℃加热 1 h或者使用胰酶、半乳糖处理菌株后可阻断其粘附。这些结果表明,MRP对 SS2的毒力起到一定的作用,参与了 SS2的治病过程。

2.2 胞外因子(EF)

胞外因子(extracellular,EF)是一种分泌型蛋白,仅可以从培养上清中检出。目前认为 MRP和 EF是 SS2的两种重要的毒力因子,Vecht等[8]发现病猪的分离株中一般含有这两种蛋白而健康猪的分离株中则大多数不含有。从欧洲国家病猪中分离得到的 SS2多为 MRP+EF+型,而北美洲则多为 MRPEF-型[9]。另外,这两种蛋白和毒力之间有着密切的关系。大多数猪源强毒菌株既有 MRP又有 EF,而人源强毒株中仅 15%为 MRP+EF+表现型,另有 74%为 MRP+EF-,MRP+EF-的表现型在人源株中较为多见,而猪源菌株中该表现型较少,且对猪仅表现温和毒力。但是有实验表明这两种蛋白对 SS2的致病性并非不可缺少的。由此可见,SS2的治病作用是多因素作用的结果,MRP和 EF的存在对 SS2的毒力没有正相关关系。

2.3 溶血素

溶血素(suilysin,sly)是由猪链球菌产生释放的具有细胞作用的毒素物质,也是一种可以被巯基活化的蛋白毒素。SS2的溶血素是一种溶细胞性蛋白毒素,而且对人的 O型红细胞最敏感。此外 SS2的溶血素还具有细胞毒性作用,可以导致人脑微血管内皮细胞产生病变,而且这种病变可以被 SS2溶血素抗体所抑制。体内研究表明,强毒菌株产生的溶血素可以增强上皮细胞的侵入和细胞溶解的作用[10]。进一步的研究表明,溶血素阳性的猪链球菌菌株可以引起粘附和细胞损伤,造成猪菌血症和脑膜炎[11]。溶血素在SS2侵袭和裂解 Hep-2细胞过程中发挥了重要的作用,说明溶血素是 SS2的重要毒力相关基因[12]。

2.4 纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)

纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)是除了 32型和 34型以外所有类型的猪链球菌都存在的一种毒力因子。猪链球菌 2型的纤维蛋白原结合蛋白(FBPS)可以粘附到人的血纤粘蛋白原和纤维蛋白原上,几乎所有菌株都存在 fbps这个基因,但是否所有的血清型中 fbps基因都表达还不清楚.。De Greeff等[13]试验证实 fbps表达产物对猪具有免疫原性,可以产生特异性抗体,作为交叉保护性抗原。试验显示,fbps基因缺失菌株的毒性低于野毒株,但是两种菌株在扁桃体内的定植没有差别而在关节和中枢神经系统的定植效率较高。Tan等[14]试验表明,fbps基因在感染 SS2的 24 h内表达上调,说明 FBPS在猪链球菌侵入的过程中发挥一定的作用。

2.5 毒力相关基因 ORF2

Sm ith等[15]通过体内互补法将 SS2强毒株基因文库引入遗传背景相似的弱毒株,之后接种无毒仔猪,从神经系统中分离病原,发现一段毒力相关的基因序列 ORF2。将 ORF2序列导入两株不同的弱毒株后发现其毒力都增强,因此认为 ORF2可能是一种新的毒力因子。有研究表明,ORF2不仅存在于 R群链球菌中,A,B,C,D等链球菌血清型中均存在,说明 ORF2是一种普遍存在的毒力因子,但是其致病作用还需要进一步的研究。

2.6 Trag基因

Trag基因是利用体内诱导抗原技术 IVIT通量筛选鉴定的 SS2性的致病相关因子,是 IV型分泌系统的组成部分[16]。Trag在大多数强毒力 SS2中均可检测到存在,而无毒力菌株 T15中则没有[17]。Trag在体外培养只是一过性表达,而在体内感染时 Trag转录水平持续上升表明可能与 SS2体内感染相关。另外,Trag在细菌感染过程中可能参与毒力因子的转移,毒力蛋白的分泌使宿主菌产生相应的酶或毒素导致毒力增强。

3 酶类

3.1 谷氨酸脱氢酶

谷氨酸脱氢酶是 Okwumabua等[18]筛选到的 45-kDa猪链球菌特异性蛋白。核算序列分析表明,GDH基因包括一个开放性阅读框,编码 448个氨基酸残基,在细胞表面表达。核酸杂交结果表明,GDH基因在所有 SS2内是保守的。将这段基因克隆表达,提纯融合蛋白制备多抗,发现此多抗能与其他分离株中分子量相同的蛋白反映,说明此基因的普遍性和它表达的保守蛋白具有免疫原性。同时,这个蛋白又能特异性的与免疫了 SS2型的猪的抗血清反应,说明它可以作为猪链球菌感染的诊断抗原。而且根据 GDH蛋白的非变性电泳图谱的不同,能够区分出高致病株、中等毒力株和无毒株。

3.2 分泌型核酸酶 A

Fontaine等[19]从致病性 SS2中发现的一种分泌型核酸酶(S.suis secredted nuclease A,SsnA)基因。通过对多种血清型猪链球菌进行基因检测和活性检测,结果发现 SsnA在多种型别的猪链球菌中都存在,但主要在猪链球菌 2型中表达。RT-PCR证明,SsnA在该菌的整个生长周期中均分泌,丙烯酰胺凝胶电泳和Western blotting进一步证明,SsnA属于胞内分泌,分布在细菌的细胞膜上,而 Ca2+和 Mg2+为 SsnA的活性必需因子。分析了分离于猪体表(鼻拭子或上颌棉拭子)和猪体内(关节、脑、其他内部器官)的猪链球菌,发现 SsnA的表达水平与菌株的分离位置密切相关,提示这可能是一种新型的毒力因子。

3.3 次黄嘌呤核苷酸脱氢酶

次黄嘌呤核苷酸脱氢酶(inosine 5'-monophoshate dehydrogenase,IMPDH)是均四聚体酶,包含 4个55Kda的亚基。IMPDH是嘌呤生物合成的关键酶,它催化鸟嘌呤核苷酸从头合成的限速步骤,依赖 NAD的协同作用,将次黄嘌呤核苷酸 XMP氧化为黄嘌呤核苷酸 XMP,然后在 GMP合成酶的催化下氨化为GMP,IMPDH受抑直接导致尿普酸水平降低。研究结果表明,除血清 17,24,32,33和34型外,IMPDH的基因还存在于其他的血清型中;IMPDH的基因能明显改变 Hep-2细胞膜的通透性,利于菌体穿过细胞膜屏蔽进入细胞内增殖,从而致病,所以推测 IMPDH的基因可能是猪链球菌2型的一个新的毒力因子[20]。

3.4 谷氨酰胺合成酶

最近研究表明,包括营养代谢在内的多个系统特别是谷氨酸代谢系统是细菌重要的毒力因子[21～24]。Si等[25]研究了 SS2中谷氨酰胺合成酶的作用,通过构建谷氨酰胺合成酶无效突变菌株分析其互补特性,吸附和侵入 Hep-2细胞,细胞毒性分析以及免疫保护分析。结果表明,谷氨酰胺合成酶对SS2的毒力起到了非常重要的作用,是 SS2的一个重要的毒力因子。

4 其他类的毒力因子

Wilson等[26]通过信号标签诱变技术发现了 22个可能和毒力有关的片段,其中 lin0523通过构建基因缺失突变株发现,缺失株对 5只实验兔没有产生任何影响,而且该基因在强毒株中存在,在弱毒株中则发生结构突变[27]。Zhang A.D.等[28]发现 IgA1蛋白酶、重组的 IgA1蛋白酶,有良好的水解 IgA1的活性,对恢复期血清有高免疫反应性,这个基因在大多数的致病菌株中存在,但是在非侵袭性的菌株中很少出现。Esgleas等[29]发现一种新的纤连蛋白结合蛋白,此蛋白与其他细菌的烯醇蛋白没有很高的同源性,但是具有烯醇蛋白酶的活性,吸附阻断实验证明烯醇蛋白酶对吸附和侵入脑微血管内皮细胞具有重要的作用。

综上所述,猪链球菌 2型的毒力因子和致病机制已经做了大量深入的研究,发现有些 SS2分离株虽然没有主要毒力因子的存在但仍然具有致病性,而有些含有主要毒力因子但致病性却很弱,说明 SS2的毒力因子存在与否和致病性之间没有正相关联系。可能是通过毒力因子之间的相互作用来产生致病性,也有可能是关键的毒力基因尚未发现。因此,各毒力因子的详细作用还有待于进一步的深入研究,加强对该病致病机理的深入认识,为进行更好的防控该病提供理论指导。

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(责任编辑:石瑞珍)