大肠杆菌耐药机制中激活外排泵和减少摄入量的研究进展

杨 峰,邢艳苹,王 瑜,雷连成

(吉林大学畜牧兽医学院,吉林长春,130062)

发现和使用抗生素一直是 20世纪重大的科学成就之一。在应用抗生素的早期,细菌感染被认为是可以攻克的。被感染的切口和创伤已经不再威胁生命,各种细菌性疾病,如梅毒、霍乱也被认为已经根除。然而,抗生素的广泛使用促使耐药性病原体的产生,其中包括多药耐药菌株的出现。耐药性迅速蔓延,特别是在各种细菌之间能够密切接触的医院,它们在接触的过程中传播着各自的耐药性。由于细菌间耐药性基因的传递转移,使耐药性也蔓延到周围的社区。

致病菌耐药性是新出现的一种全球性危机,理解耐药机制对于设计和开发新的治疗策略至关重要[1,2]。药物分子的通透性屏障和外排泵激活是致病菌导致疾病爆发的两个重要机制,这表明这些机制可能是是新药物设计的重要靶位[3]。外排泵和摄入量减少的协同作用是在外膜外排泵和摄入量的通透性屏障倍增的明显机制,导致临床大肠杆菌耐药的固有的或者获得的高水平耐药。

细菌药物外排系统在消耗能量的前提下泵出细菌体内非自身化学成分或结构的化合物,而并不改变药物分子或是使其降解。几种现有的细菌基因序列的分析表明,在任意所给的细菌中已知和假定的药物外排转运体占细菌体内全部运转体的 6%～8%[4～6]。

在大多数情况下,多药外排转运体是由染色体编码的,因此不容易在细菌间转移。然而,在革兰氏阳性和阴性菌的可动因子中都发现过(转运体基因)。许多情况下耐药的产生是由于减少摄入量与药物外输间的协同作用。

1 外排系统

1.1 主易化家族(MFS)

催化药物外排的 MFS家族蛋白隶属 3个亚科,药物/H逆向转运子 DHA1,DHA2,DHA3。DHA1和DHA2蛋白家族在原核生物和真核生物界是普遍存在的,并且能够外排不同结构的多种药物,范围很广。

DHA 1家族的成员泵出糖类、多胺类、解偶联剂、单胺类、乙酰胆碱、百草枯和丙酮醛。与此相反,DHA 2家族成员具有更加严格的底物特异性,转运底物包括胆盐和染料。DHA3家族只在原核细胞中发现,已知能外排抗生素[7],如:大环内酯类和四环素。

1.2 ATP结合盒超家族(ABC)

ABC转运家族同时包含吸收与外排运输系统。这个家族的成员利用 ATP水解产生的能量运输多种物质,如糖类、氨基酸、离子、药物、多糖和蛋白质。ABC家族包括内膜蛋白(推测是细胞膜上膜孔蛋白)和具有 ATP酶活性胞浆蛋白。细菌 ABC透明质酸酶通常包含 6个 TMS,每个都以异源二聚体的形式成对连接到膜上[8～10]。两个 ATP酶亚基在细胞内膜的胞质面与透明质酸酶相关联,形成一个功能转运体。细菌中属于 ABC家族的药物外排泵是少有的,研究得最好的是乳酸乳球菌的 Lm rA泵。当前属于 ABC超家族的有 21个原核外排体系统。

1.3 小多药耐药家族(SMR)

小多药耐药家族。与名称相符,这一家族转运子包含约 110个氨基酸残基,4个跨膜区,通过质子动力势供能。由于它们分子量较小,SMR蛋白最初以三聚体的形式执行功能。然而,最近的一项研究表明,它们实际上是以四聚体的形式存在的。这个家族的特异性外排泵包括金葡菌的 Smr外排泵和大肠杆菌的 Em rE外排泵,泵出染料,药物和阳离子。

1.4 耐药结节化细胞分化族(RND)

革兰氏阴性菌中,RND泵由包含 12个跨膜区的 RND膜转运蛋白与一个周质融合蛋白和一个外膜通道蛋白组成。RND转运子的拓扑学特点是在跨膜片段 1-2,7-8之间有两个大的亲水性片段,且 N末端和 C末端之间无对称外形。1个分支杆菌球菌 RND只有 6个跨膜区,没有内部重复序列。很可能蛋白是作为二聚体,异二聚体或与其它蛋白协同发挥作用。这类家族中研究得最好的是大肠杆菌的 AcrAB-tolc系统和铜绿假单胞菌的 MexAB-Oprm系统,已知这 2个外排泵外排抗生素、重金属、染料、去污剂、溶剂以及许多其它底物。

1.5 多药及毒性化合物外排族(MATE)

以前认为 MATE家族蛋白属于 MFS超家族,现在人们将它们看做一个单独的家族,因为虽然具有相似的膜拓扑结构,然而与 MFS蛋白并没有序列同源性。副溶血性弧菌的 NorM和其同系物大肠杆菌的 YdhE即属于这一家族。这些蛋白长约 450个氨基酸残基,包含 12个跨膜区[11]。这一家族的蛋白以钠离子梯度作为能量的来源外排阳离子染料和喹诺酮类药。

2 大肠杆菌的 RND外排泵

大肠杆菌的基因组分析显示存在着 7个 RND转运子。迄今为止,其中的 5个已经研究了其功能特点,并被证实参与药物的外排:AcrAB,AcrEF,AcrD,YhiUV,和 MdtABC。目前进行研究的所有大肠杆菌RND泵都发现其与 TOLC外膜通道相关联。AcrAB-Tolc已经被鉴定为此类菌中最突出的药物外排泵。而且它具有 RND家族泵的典型特点。敲除 AcrEF,YhiUV,MdtABCD的实验显示,野生型大肠杆菌对药物的敏感性并未改变,这说明这些泵在大肠杆菌抗生素抗性上并没有显著的作用。

AcrAB-Tolc系统显示出了非常广的底物特异性[12]。它的底物包括吖啶黄,ħ-内酰胺类,胆盐,氯霉素,结晶紫,溴化乙啶,脂肪酸,大环内酯类抗生素,有机溶剂,氟喹诺酮和 SDS。AcrD泵最初被认为是作为一个单一组分泵而排出氨基糖苷类药物,但是最近更多的数据表明实际上它需要与 AcrA和 Tolc一同排出胆盐,新生霉素和氨基糖苷类物质。AcrEF泵不存在于野生型大肠杆菌,但是在缺乏 AcrAB泵的抗氟喹喏酮突变体中表达。这个外排系统也能引起大肠杆菌对溶剂的抗性。有趣的是,AcrF蛋白在与 AcrA和 Tolc同作用时排出溶剂,说明组成 RND的组分之间可能是可以互换的。

2.1 RND外排泵的结构和功能

2.1.1 外膜通道蛋白 OprM由 3个蛋白分子组合而成,形成一个独特的结构,构成一个连续穿过周质空间和外排的通道。每个蛋白单体提供 4个链以形成桶状,由此组成12个链的 β2桶状结构域,此结构位于一个由 12个链盘绕的穿过周质空间的 α2螺旋孔道之上[13]。

2.1.2 RND内膜转运子 AcrB转运蛋白的高溶解度结晶结构显示,其为 MexB同族体。3个 AcrB原体聚合成一同源三聚体结构,包括 3个不同的区域:1个跨膜区,1个孔道区,1个 Tolc结合区。孔道区与 Tolc结合区向周质中突出一个 7 nm的部分,足够与 Tolc末端自然接触形成通道[14]。相邻原体周质区之间的孔腔被认为是底物结合区。每个原体都由一突出的帽样结构和一含有 12个跨膜螺旋结构的跨膜区域组成。MexB和 MexD的膜拓扑结构与 12个跨膜片断模型一致,在模型中,氨基和羧基端位于内膜的胞质面,第 1和第 4周质循环各有 1个氨基酸残基的亲水区域,这 2个循环与膜融合蛋白和(或)外膜蛋白相互作用。

2.1.3 膜融合蛋白 绿假单胞菌的 MexA结构显示它是以一个环状 C结构与外膜通道蛋白和 RND转运子相互作用。同时也存在几种与 MexA与 OprM和 MexB相互作用不同的模型。无论其中膜融合蛋白的具体作用是什么,总之,其在外排泵的组成和功能上是不可或缺的。

2.2 RND外排泵的组装

一项最近的研究显示,在底物分子存在或不存在的情况下,AcrA,AcrB和 TolC等 3种蛋白组装成具有功能性的 AcrAB-TolC泵。然而,这与我们在实验室中观察到的铜绿假单胞菌 MexJK-OMP泵的功能性装配具有底物依赖性不同。在三氯森存在的情况下,MexJK与 OpmH装配成 MexJK-OpmH三氯森外排泵。相反的,在乙琥红霉素存在的情况下,MexJK与 OprM装配成 MexJK-OprM乙琥红霉素外排泵。这说明外排泵结构在不同 RND家族蛋白的组成机制上存在巨大的多样性。这是有意义的,因为铜绿假单胞菌有 50%的 RND外排泵操纵子并不编码自身的外膜通道蛋白,因此必须依赖其它外膜通道蛋白的表达,比如 OprM家族,来组装成具有功能性的外排泵[15]。

2.3 RND外排泵的固有功能

不同 RND泵的固有功能依然是一个需要探讨的话题。人们最初认为这些泵是革兰氏阴性菌抵抗环境抗菌剂和其它毒素的一种防御机制[16,17]。然而,对它们种系发生的研究指出,在革兰氏阳性菌、古细菌甚至人类中存在 RND的同系物。AcrAB敲除株对胆盐具有高度敏感性,说明大肠杆菌中的 AcrAB泵对胆盐有较高的亲和力。大肠杆菌的原属地在肠道内,环境中充斥着胆盐,因此外排胆盐是其自身的一种防护机制。另外,外排泵的固有功能还包括:移除毒素、代谢产物以及缓冲有毒代谢产物对机体的冲击,可能还包括细胞与细胞间信号转导时信号分子的传递。

2.4 RND外排泵基因表达的调控

编码外排泵不同组分的操纵子都包含 1个连锁调节基因。例如,大肠杆菌 acrR与 acrAB分别转录,编码 1个 TetR抑制家族的抑制物。众所周知,AcrR同时抑制其自身和 acrAB的转录。AcrR在大肠杆菌临床菌株获得氟喹喏酮类耐药性中起到的作用是中国的一项研究证实的[18～20]。该研究在 acrR突变和 acrAB过表达引起的高水平氟喹喏酮类耐药之间找到了联系。显示出 AcrR的主要作用是阻碍 acrAB表达。

研究表明,大部分铜绿假单胞菌的 RND多药外排系统通过连锁调剂基因调控,这些基因编码阻遏物或激活物。mexAB-OprM操纵子上游的 DNA序列有一开放读码框(ORF),编码蛋白 MexR,这是一转录抑制蛋白,属于MarR抑制家族,与 mexAB-OprM的转录反方向。基因 mexR的失活导致 MexAB-OprM的过度表达和多重耐药的表现。

高表达 MexAB-OprM的临床株常带有 mexR的突变。mexCD-OprJ的调节与 NfxB抑制蛋白有关,由定位于 mexCD-OprJ操纵子上游的 n fxB基因编码。囊性纤维变性菌株长期接触环丙沙星导致 nfxB突变,表达 MexCD-OprJ。mexEF-OprN由属于转录增强子的 LysR家族的 Mex T正调节。与其它调节子相比,作为唯一一个正调因子,其作用机制是独特的。基因 mex T定位于 mexEF2oprN的上游,两者转录同方向。当 Mex T过度表达时,诱导 mexEF2op rN操纵子的表达和 OprD(外膜通道)的低表达。Mex-EF2OprN过度表达的 nfxC突变株的突变位点不在 mex T基因上,提示有其它基因通过 mexT控制 Mex-EF-OprN的表达。

各种外排泵的表达也受不同的整体调控子调节,其中研究得最好的是大肠杆菌的 AcrAB-TolC外排泵。到目前为止,几种整体转录激活因子,包括 MarA,SoxS和 Rob均参与了该泵的表达调控。Mar基因座由 marRAB操纵子和 marC组成。MarR是抑制物,MarA是激活物,MarB和 MarC的功能依然不清楚。

MarA是 AraC转录激活因子家族的成员,除了激活自身转录外,还激活其它大量基因。包括 acrAB,tolC和 micF。下调 ompF的表达,OMP通道为各种抗生素进入菌体的途径。MarA在抗菌剂存在的条件下使 Ompf低表达,AcrAB-TolC过表达,为大肠杆菌提供了一个高效抗菌的机制。总体而言,MarA激活 mar调节子的表达,包括 acrAB,tolC和 marRAB[21,22]。而 MarR通过抑制 MarA来抑制 mar调节子的表达。如大肠杆菌,在产气肠杆菌中 marA过表达导致耐药性增加,极可能是由于膜孔蛋白表达减少而主动外排增加。

3 克服外排

随着 RND运载体在革兰氏阴性菌临床抗生素耐药性产生的重要意义被证明,这些外排泵在药物开发着手点上起着重要的作用,并且作为真正的药物靶位促进联合治疗的发展。这些泵的抑制剂可能在不同的层面上得以实现:通过抑制与药物结合的内膜泵;或者通过抑制多组分泵的不同组成成分,或者针对外排泵的能量来源,或者通过作用于调节外排泵表达的调控途径来抑制外排泵。

在过去的 10年也发现了一系列的外排泵抑制剂。第一个广谱 RND泵抑制剂是 MC-207,110(苯丙氨酸精氨酸 b萘胺)。这种抑制剂使左氧氟沙星对铜绿假单胞菌的活力增高 8倍,对MexAB-OprM过表达株活力增加 64倍。重要的是,EPIs减少了左氧氟沙星自发抗性菌株的发生,并且对绿脓杆菌感染的动物模型有效。类似的化合物被证明泵抑制产气肠杆菌和弯曲杆菌属的外排泵。人们认为这类化合物是通过抑制抗生素与泵之间的特异性结合位点来发挥作用的。Benastatins从一种放线菌的发酵液中得到的另一种化合物能够有效对抗铜绿假单胞菌 MexAB-OprM的表达。其它细菌不同来源的 EPIs也已经被鉴定出来。几个四环素衍生物能够抑制 TetB外排泵。其中最强大的是一种强力霉素的衍生物——13-CPTC。与上述抑制剂相反,13-CPTC具有自身的抗菌特性,能够作用于脂多糖缺陷型大肠杆菌和金葡菌。13-CPTC与强力霉素结合使强力霉素的最小抑菌浓度值降低到原来的 1/10～1/4。从植物中分离出来的抑制剂并不显示内在的抗菌活性,但是能够通过抑制 NorA泵增强氟哌酸对金葡菌的效应。

抑制剂和目前的抗菌类药联合治疗能够恢复耐药性细菌对抗生素的敏感性。然而,这种途径存在风险:它对真核细胞具有潜在的不良影响,比如毒性,比如对真核生物结构和功能相似性运转体的抑制。

绕过外排泵也可能有可行的办法。可以从开发新药上入手:开发不在这些外排泵作用范围内的新药。事实上,一些较新的氟喹喏酮类似乎不在革兰氏阴性菌的主要外排泵的作用范围,然而目前还不清楚药物活性的增加是由于对靶位的高亲和力还是对这些泵的低亲和力。正如前面所说的,总是存在抗生素接触诱导产生新的外排泵的风险。GRA-936就是一个例子。GRA-936不是 Tet泵的作用底物,然而,甘氨酰环素是许多革兰氏阴性菌的 RND泵底物[23～25],包括铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和摩根菌。这些因素使它对革兰氏阴性菌无效。脂多糖的存在是脂双分子层对输水物质如抗生素和去污剂不具渗透性的原因。脂多糖在对抗抗生素时起到屏障的作用,大肠杆菌和美国副伤寒沙门氏菌类脂 A和脂多糖中心缺陷株较野生株对乙琥红霉素、罗红霉素、克拉霉素和阿奇霉素的敏感性增加 4倍。

4 结论和讨论

减少外膜的通透性也就减少了抗生素的吸收导致低水平的耐药性。在药物外排泵存在的情况下,耐药性在减少射入和主动外排协同作用下被成倍放大,形成高水平的耐药性。基因序列分析表明,这些外排泵分布较广,这样预示着它们可在病原体范围内进行基因交流。实验证明确实如此。需要特别注意的是,这些外排泵广泛的底物特异性,可以抵消新药的作用效果。比如替加环素,甚至是实验试剂,大部分都是大肠杆菌 E.coliAcrAB-TolC泵的底物[26～28]。外排泵既影响了药物有效性,同时却又促进药物开发的进展。

5 展 望

新疗法不仅包括避开外排泵提高新药的渗透性,还包括应用广谱外排泵抑制剂提高现有的抗菌剂的效力。基因组分析的最新进展提示,在分子结构的可行性和对功能以及外排系统调控方面的深入理解将推动以外排泵为靶位点的新药的开发[29～31]。

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(责任编辑:朱宝昌)