反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

孔艳，吴小红，杨立宏，安祺，董关木，俞永新

反转录酶活性检测实时荧光定量PCR方法的建立

孔艳，吴小红，杨立宏，安祺，董关木，俞永新

【摘要】

【关键词】聚合酶链反应； RNA 指导的 DNA 聚合酶

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(6):438-441

实时荧光定量 PCR 技术是由美国 Applied Biosysems 公司推出，在 20 世纪 90 年代发展起来的核酸定量技术。该技术是在 PCR 反应系统中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时检测整个PCR 过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。由于引入了荧光标记探针提高了方法的高灵敏性，可直接监测扩增过程中的荧光信号变化获得定量结果，定量和扩增同步进行，克服了PCR 平台效应的特点，能实现多重反应、无污染，因此具有高精确性、高特异性、实时性和可靠性等特点。目前已被应用于病原体测定、肿瘤基因检测、免疫分析以及基因表达、突变和多态性研究等多个领域。

反转录酶是所有反转录病毒的一个重要标志，目前普遍应用的检测反转录病毒方法是以 PCR 为基础的产物增强性反转录酶（product enhanced reverse transcriptase，PERT）活性检测法。我们曾经在国内首次报道了反转录酶的 PERT 检测方法，但传统 PERT 方法在实验过程中容易造成污染和假阳性，并且无法做到实时监控。为此，我们在原有方法的基础上[1]，以噬菌体 MS2 RNA 为模板合成引物和探针，尝试建立一种检测反转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法。

1 材料与方法

1.1 材料

噬菌体 MS2 RNA、反转录试剂盒、AMV 反转录酶（AMV Rtase）、核糖核酸酶抑制剂（RNasin）均购自美国 Invitrogen 公司；定量 PCR 预混合液和 Applied Biosysems7500 型定量 PCR 仪购自美国 Applied Biosystems 公司。

1.2 方法

1.2.1 引物和探针的设计与合成 在我们以往设计引物的基础上，以噬菌体 MS2 RNA为模板设计引物 RT-1 和 RT-2。RT-1 序列为 5’ d（GCCTTAG CAGTGCCCTGTCT）3’，RT-2 序列为 5 ’d（AACAT GCTCGAGGGCCTTA）3’；再合成一条探针（Probe），并分别在其 5’ 端引入 FAM 羧基荧光素，3’ 端引入 TAMRA 荧光素，Probe 序列为 5’FAM-CCCGTGGGATGCTCCTACATGTCA-TAM RA 3’。引物和探针均由上海常茂生物化学工程有限公司合成。

1.2.2 反转录反应 反应总体积为 25 μl，其中包括 10 × RT Buffer 2.5 μl、20 mmol/L RT-1 2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 1 μl、40 U/μl RNasin 0.5 μl、0.5 mmol/L DTT 0.5 μl、MS2 RNA 2 μl、25 mmol/L MgCl20.5 μl、不同稀释度的 AMV 反转录酶 2 μl、水 14 μl，反应条件为：37 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min。其中以水代替 MS2 RNA 作为阴性对照，即整个反应体系无模板。

1.2.3 实时荧光定量 PCR 反应 反应总体积为 20 μl，其中包括定量 PCR 预混合液 10 μl、20 mmol/L RT-1 1.8 μl、20 mmol/L RT-2 1.8 μl、Probe 0.5 μl、反转录反应产物 cDNA 0.5 μl、水5.4 μl。加样至 96 孔定量 PCR 反应孔中，每个样品同时设 3 孔。在 Applied Biosysems7500 型定量 PCR仪上扩增，扩增循环参数为：95 ℃ 15 s，56 ℃ 33 s，72 ℃ 40 s，共 45 个循环。

1.2.4 传统 PERT 方法 反应总体积为 50 μl，其中包括 25 μl 反转录反应混合液（10 × RT Buffer 2.5 μl、20 mmol/L RT-1 2 μl、2.5 mmol/L dNTPs 1 μl、40 U/μl RNasin 0.5 μl、0.5 mmol/L DTT 0.5 μl、MS2 RNA 2 μl、25 mmol/L MgCl20.5 μl、不同稀释度的AMV反转录酶 2 μl、水 14 μl），反应条件为：37 ℃30 min，95 ℃ 5 min，用于去除 RNasin 的活性。再加入 25 μl PCR 混合液（定量 PCR 预混合液22 μl、20 mmol/L RT-2 2 μl、RNase H 0.5 μl、Taq酶0.5 μl），PCR循环反应条件为：95 ℃ 10 s，55 ℃20 s，72 ℃ 30 s，共 30 个循环；72 ℃ 延伸 10 min。反应完毕，取 10 μl PCR 扩增产物行 2% 琼脂糖凝胶电泳，加样后 80 V 电压下电泳 30 min，紫外线灯下观察电泳条带并拍照。

1.2.5 方法敏感性的测定 以市售纯化的 AMV反转录酶为标准品，行连续 10 倍倍比稀释至 1 × 10-1～ 1 × 10-9U/μl后，分别加入反转录反应体系进行反转录，反转录步骤与“1.2.2”中步骤相同，取反转录反应产物 0.5 μl 用于实时荧光定量 PCR反应，每个稀释度设 3 孔。剩余的 24.5 μl 反转录反应产物，加水补足 25 μl 后，再加入 25 μl 的PCR 混合液，应用传统 PERT 方法进行扩增。

2 结果

2.1 实时荧光定量 PCR 方法的敏感性

将上述含有不同稀释度 AMV 反转录酶的反转录反应产物加入实时荧光定量 PCR 反应体系，经 PCR 循环反应，得到与理论值完全相符合的PCR 荧光值曲线。定量分析结果显示，浓度为 1 × 10-1U/μl 的 AMV 反转录酶无扩增反应，可能是由于酶浓度太高，反应被抑制，无标准曲线出现。从浓度为 1 × 10-2U/μl 的 AMV 反转录酶开始出现扩增反应，当 AMV 反转录酶浓度达到 1 × 10-8U/μl时仍可检测到相应的荧光值（图 1、表 1）。

图 1 连续 10 倍倍比稀释 AMV 反转录酶的实时荧光定量 PCR 曲线Figure 1 Real-time fluorescence quantitative PCR curves of 10-fold serial dilution AMV Rtase

表 1 连续 10 倍倍比稀释 AMV 反转录酶的实时荧光定量 PCR 荧光值Table 1 Real-time fluorescence quantitative PCR fluorescence of 10-fold serial dilution AMV Rtase

2.2 传统 PERT 方法灵敏度

上述不同稀释度的 AMV 反转录酶，经传统PERT 方法扩增，所得扩增产物经 2% 琼脂糖凝胶电泳后，在 112 bp 处观察有无阳性条带出现。结果显示含高浓度（1 × 10-1、1 × 10-2U/μl）AMV 反转录酶的扩增反应被抑制，从浓度为 1 × 10-3U/μl的 AMV 反转录酶开始可见大小为 112 bp 的阳性条带，检测灵敏度达到 1 × 10-7U/μl（图 2）。

图 2 分别加入连续 10 倍倍比稀释 AMV 反转录酶的传统 PERT 方法的灵敏度Figure 2 The sensitivity of the traditional PERT method with 10-fold serial dilution AMV Rtase

3 讨论

反转录酶是一种依赖 RNA 的 DNA 聚合酶，是反转录病毒特有的一种酶类，凡是反转录病毒中均携带反转录酶，通过检测反转录酶活性指标可达到监测生物制品反转录病毒污染的目的。我们根据模板噬菌体 MS2 RNA 设计引物及探针，建立了检测反转录酶活性的实时荧光定量 PCR 分析方法，对生物制品中反转录酶活性测定具有较高的应用价值。

本研究结果发现，用传统 PERT 方法与实时荧光定量 PCR 方法进行比较，整个反转录过程一致，但是实时荧光定量 PCR 方法所使用的模板量仅为传统 PERT 方法的 1/50，也就是说体系中使用的反转录酶量是传统方法的 1/50 时，灵敏度就可达到传统方法的 50 倍模板量的结果，无论定性还是定量分析，目标都是 PCR 扩增后的终产物。但是在许多情况下，我们所感兴趣的是未经 PCR 扩增信号放大之前的起始模板量，通过确定标准品反转录酶的量，间接测出底物 cDNA 模板量，得到标准荧光值曲线，从而间接推测样品中有无反转录病毒污染。结果显示 AMV 反转录酶标准品经 PCR循环反应后可得到与理论值完全相符合的 PCR 荧光值曲线；当 AMV 反转录酶稀释到浓度为 1 × 10-8U/μl 时，仍可得到相应的荧光值，证明具有较高的敏感性，整个实验过程操作简单、快捷，而且不必使用对人体有害的染色剂[2]。

由于新病毒的发现和科学技术的进步，尤其是反转录病毒对生物制品细胞基质及原代细胞的潜在污染[3]，使得 WHO 多次就有关问题进行讨论，但是 WHO 目前还没有统一的国际参考品以及假阳性结果等一直是困扰各个实验室的重要问题[4]。此次，在传统 PERT 方法的基础上，我们建立了反转录定量 PCR 检测方法，使得检测灵敏度进一步增强；并试图通过实时荧光定量 PCR 方法，建立一套检测标准，采用对纯化的反转录酶进行连续倍比稀释后得到标准荧光值曲线，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。与传统 PERT 方法比较，反转录定量 PCR 检测方法可直接监测扩增过程中的荧光信号变化进行定量分析，而且其高精确性和无污染性也减少了实验过程中假阳性结果的产生。

综上，我们所建立的检测反转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法与传统 PERT 方法相比，实验操作过程简单，所使用的起始模板量仅为传统PERT 方法的 1/50，不仅能降低气溶胶等外来核酸造成的污染，同时能通过样品的 PCR 扩增产物荧光值曲线对感染病毒的数量进行精确定量。

参考文献

[1] Pyra H, Böni J, Schüpbach J. Ultrasensitive retrovirus detection by a reverse transcriptase assay based on product enhancement. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994, 91(4):1544-1548.

[2] Lovatt A, Black J, Galbraith D, et al. High throughput detection of retrovirus-associated reverse transcriptase using an improved fluorescent product enhanced reverse transcriptase assay and its comparison to conventional detection methods. J Virol Methods, 1999, 82(2):185-200.

[3] Chang A, Ostrove JM, Bird RE. Development of an improved product enhanced reverse transcriptase assay. J Virol Methods, 1997, 65(1): 45-54.

[4] Lugert R, König H, Kurth R, et al. Specific suppression of false-positiv signals in the product-enhanced reverse transcriptase assay. Biotechniques, 1996, 20(2):210-217.

ObjectiveTo develop a real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity, based on the traditional product enhanced reverse transcriptase (PERT) activity detection method.

MethodsBased on phage MS2 RNA as a template to design and synthesize primers and probe, AMV reverse transcriptase standard in a continuous of 10-fold serial dilution (1 × 10-1- 1 × 10-9U/μl) were used to catalyze reverse transcription reaction in vitro and synthesize cDNA. Using real-time fluorescence quantitative PCR method to detect the amount of substrate cDNA template, obtaining the real-time fluorescence quantitative PCR curves and analyzing the relative activity of the AMV reverse transcriptase. The traditional PERT method was used to amplify cDNA, and determining the sensitivity of the method.

Results Using AMV reverse transcriptase standard in a continuous of 10-fold serial dilution to catalyze the reverse transcriptase reaction, and the real-time fluorescence quantitative PCR method to analyze the reverse transcriptase products cDNA, the standard real-time fluorescence quantitative PCR curves fully consistent with the theoretical value were obtained; the quantitative analysis showed that the concentrations of 1 × 10-2- 1 × 10-8U/μl of AMV reverse transcriptase could get the corresponding fluorescence values. After different dilutions AMV reverse transcriptase were amplified by the traditional PERT method, the results showed the concentrations of 1 × 10-3- 1 × 10-7U/μl of AMV reverse transcriptase appeared the size of 112 bp positive band, the detection sensitivity was 1 × 10-7U/μl.

ConclusionThe new real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity was established successfully, the operation process was simple, and with high accuracy and non-polluting, it could provide a reference for detection of biological products external contamination, and especially retrovirus contamination.

【Key words】Polymerase chain reaction; RNA-directed DNA polymerase

Author Affiliation: The National Institute for the Control of Pharmaceutical and Biological Products, Beijing 100050, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):438-441

目的在传统产物增强性反转录酶（PERT）活性检测方法基础上建立检测反转录酶活性的实时荧光定量 PCR 方法。方法 以噬菌体 MS2 RNA 为模板，设计、合成引物和探针，并分别以连续 10 倍倍比稀释的 AMV 反转录酶（1 × 10-1～ 1 × 10-9U/μl）标准品催化体外反转录反应合成相应cDNA。采用实时荧光定量 PCR 法检测底物 cDNA 模板量，并获得相应的 PCR 荧光值曲线，分析 AMV 反转录酶的相对活性。同时应用传统 PERT 方法对 cDNA 进行扩增，测定该方法的灵敏度。

结果将 AMV 反转录酶标准品连续 10 倍倍比稀释后催化反转录反应，实时荧光定量 PCR 分析所得的反转录产物cDNA，结果得到与理论值完全相符合的 PCR 标准荧光值曲线；定量分析结果显示，浓度为 1 × 10-2～ 1 × 10-8U/μl 的AMV 反转录酶均可得到相应的荧光值。不同稀释度的AMV 反转录酶，经传统 PERT 方法扩增后，结果显示浓度为 1 × 10-3～ 1 × 10-7U/μl 的 AMV 反转录酶均可见大小为 112 bp 的阳性条带，检测灵敏度达到 1 × 10-7U/μl。结论 成功建立了基于实时荧光定量 PCR 技术的检测反转录酶活性的新方法，实验操作简单，具有高精确性和无污染性，为生物制品外来污染尤其是反转录病毒污染的检测提供了参考指标。

Corresponding Author:KONG Yan, Email: kongy62@yahoo.com.cn www.cmbp.net.cn

作者单位：100050 北京，中国药品生物制品检定所

通讯作者：孔艳，Email：kongy62@yahoo.com.cn

收稿日期：2010-09-13

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.008

Development of a real-time fluorescence quantitative PCR method for detection of reverse transcriptase activity

KONG Yan, WU Xiao-hong, YANG Li-hong, AN Qi, DONG Guan-mu, YU Yong-xin

【Abstract】