表达特定免疫球蛋白可变区抗原的人B细胞系建立和其生物学特征

刘辉，朱平

表达特定免疫球蛋白可变区抗原的人B细胞系建立和其生物学特征

刘辉，朱平

【摘要】

【关键词】淋巴瘤，B 细胞； 免疫球蛋白类； 疫苗

www.cmbp.net.cn 中国医药生物技术, 2010, 5(6):410-414

淋巴瘤治疗是目前肿瘤治疗的难题之一，虽然目前用放化疗取得了一定效果，但还不能彻底治愈这类肿瘤。近年发展的过继性免疫治疗有望开辟新的肿瘤治疗途径。在淋巴瘤的过继免疫治疗中，可以用永生化人 B 细胞系作为抗原刺激物，激活患者的淋巴细胞生成特异性的细胞毒 T 细胞（CTL）。以往 B 淋巴瘤研究发现，B 淋巴瘤的表面免疫球蛋白抗原和正常 B 淋巴细胞类似，同样可以按照 Lefranc 提供的方法分类。这种分类是根据 B 细胞表面免疫球蛋白框架区的序列同源性，将 B 细胞或者淋巴瘤细胞分为 IgHV1 ～ IgHV7七个家族[1]，每一种肿瘤 B 细胞也分属于其中的一个家族。淋巴瘤中 IgHV3 家族最大，约占淋巴瘤的 30% 左右。用同一家族的 B 细胞作为抗原，刺激培养中的淋巴细胞，可以诱导相应的 CTL 产生。此外，CTL 在识别 B 细胞表面免疫球蛋白抗原时，必须具有同样类型的人白细胞抗原（HLA）。在 HLA 类型中，HLA-A*0201 是在中国人群中最常见的类型之一。尽管目前国内外已建立了一些B 细胞肿瘤细胞系[2-3]，但是迄今未见报道有同时表达 HLA-A*0201 和 IgHV3 家族的人 B 细胞系。本研究中我们建立一株 HLA-A*0201 和IgHV3 都表达的永生化 B 细胞系，并对其相应的生物学特征进行鉴定。

1 材料和方法

1.1 主要材料

1.1.1 细胞标本 取 29 例健康志愿者外周血建立永生化细胞系，标本由北大第一医院杨艳玲教授惠赠。要求供者既往无疾病史和手术史，并签署了知情同意书。

1.1.2 主要试剂 RPMI 1640 培养基和胎牛血清购自美国 Hyclone 公司；DNA 提取试剂盒购自美国 Axygene bioscience 公司；PCR 试剂盒购自天根生化科技北京有限公司；HLA SSP 位点分型试剂盒购自美国 Pel Freez Dynal 公司；IgHV1 ～ IgHV7家族 PCR 引物由美国 Invitrogen 公司合成；各种CD 分子抗体和 T 细胞受体（TCR）均为美国 BD公司产品；青霉素/链霉素双抗试剂购自北京索莱宝科技有限公司；其他化学试剂为国产分析纯；B 淋巴细胞培养体系为在 RPMI 1640 培养基中加入热灭活的 10% 胎牛血清、5 mmol/L 谷胺酰胺、1.6% Hepes、100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素，并用氢氧化钠调节pH 值在 7.0 ～ 7.2。

1.1.3 主要仪器 TS100 型倒置相差显微镜为日本 Nikon 公司产品；Alpha 2200 型凝胶像系统为美国 Innotech 公司产品；PCR Thermal Cycler 热循环仪为美国 ABI 公司产品；FACScan 流式细胞仪为美国 BD 公司产品；染色体自动图像分析仪为美国 Applied Immage 公司产品。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞建系过程 分别鉴定样本的 HLA 类型，然后按照文献描述的方法，以 Epstein-Barr 病毒（EBV）转染采集的健康人外周血淋巴细胞、鉴定后冻存[4-6]。将 EBV 转染成功的外周血淋巴细胞复苏、体外培养 1 周后，用台盘蓝染色，观察细胞活力并计数细胞浓度。用含 20% 胎牛血清的 1640 全培养基将细胞浓度稀释为 100、50 和10 个/ml 三个不同浓度的稀释度。在 96 孔培养板中，每个稀释度 32 孔，每孔加入各浓度细胞100 μl，定量至 200 μl。放置在 37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。每 3 天换液一次。细胞培养 1 ～2 周后倒置显微镜下观察挑选增殖的克隆，转移至48 孔培养板中继续培养，每 3 天半量换液一次。细胞培养 1 ～ 2 周后挑选增殖的克隆，转移至6 孔培养板中培养。将 96 孔板中增殖的克隆重复有限倍比稀释法两次后，依次转移至 48 孔板、6 孔板、培养瓶中培养。传代 80 次后细胞增殖良好，提取 DNA 并进行相应的生物学鉴定。

1.2.2 DNA 提取 按照 Axygene bioscience 公司的 AxyPrepTMBlood Genomic DNA miniprep kit试剂盒说明书提取，具体如下：取 250 μl 细胞悬液加入 AP1 Buffer 液 500 μl，振荡 10 s 后，加入AP2 Buffer 液 100 μl 混匀后振荡 10 s。室温下，12 000 × g 离心 10 min，吸取上清。上清在 2 ml 离心管中过 mini prep 柱，6 000 × g 离心 1 min，倒掉滤液。加 700 μl W1A buffer 液过 min prep 柱，室温静置 2 min 后，6 000 × g 离心 1 min，弃去滤液。加 500 μl W2 buffer 液过柱，12 000 × g 离心1 min，弃去滤液。将 min prep 柱放在 1.5 ml EP 管上，加 80 ～ 200 μl TE 缓冲液洗柱，静置 2 min 后，12 000 × g 离心 1 min 后得到 DNA。

1.2.3 PCR 方法检测 IgHV 家族表达 设计合成 IgHV1-7 个家族的引物序列（5’-3’），如下：VH1/7：CATGGACTGGACCTGGAG；VH2：CACA CTTTGCTCCACGCTC；VH3：GCTGGGTTTTCCT TGTTG；VH4：TGGTGGCAGCTCCCAGAT；VH5：CCCTCCTCCTGGCTGTTC；VH6：CTTCCTCATCT TCCTGCCC。下游引物序列为：JH：ACCTGAGGA GACGGTGACC，以 ZP-1 细胞 DNA 为模板，利用上述引物进行 PCR 扩增。PCR 反应总体系为25 μl：Mix buffer 12.5 μl；DNA 模板 1 μl；引物1 μl；dd H2O 5.5 μl。PCR 反应条件为：94 ℃ 预热3 min，94 ℃ 40 s；60 ℃ 50 s；72 ℃ 1 min；30 个循环后，72 ℃ 延伸 7 min。将 PCR 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳。

1.2.4 PCR-SSP 方法检测 HLA 分型 将提取的 DNA 按照 Pel freez 试剂盒说明书步骤进行，以 PCR-SSP 方法检测 HLA 低分辨位点和HLA-A*02 高分辨位点的表达。

1.2.5 流式分析细胞表面免疫表型 将 ZP-1 细胞用 PBS 洗涤 2 次，400 × g 离心 5 min 后，弃上清。以 50 μl PBS 重悬细胞后，分别加入 10 μl抗 CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD5、CD25、抗 lambda、抗 kappa、抗 TCRalpha、抗 TCRbeta、避光孵育 15 min 后，加入 200 μl PBS 洗细胞，400 × g 离心 5 min 后，弃上清，PBS 洗细胞2 遍后，加入 200 μl PBS 重悬细胞，上机检测。

1.2.6 细胞遗传学分析 将细胞在 37 ℃ 5% CO2孵箱中培养 24 h。终止培养前 2 h 加入秋水仙碱，终浓度 0.1 μg/ml，轻摇匀，放回 37 ℃、5% CO2孵箱中培养。24 h 后，取出培养物，250 × g 离心10 min，弃上清。然后加入预热的低渗液 0.075 mol/L KCl，混匀后在 37 ℃ 水浴箱中水浴 30 min，在终止低渗前 1 min 加入固定液，混匀后固定 10 min，250 × g 离心 7 min，固定 3 次后，将标本置于4 ℃ 冰箱过夜。

2 结果

2.1 HLA 分型结果

29 例样本中做 HLA-A 筛查，9 例为HLA-A*0201 阳性细胞。最终建立的永生化细胞系命名为 ZP-1 细胞，其 HLA 检测结果显示HLA-A* 低分辨率位点为 HLA-A*01、HLA-A*02；HLA-B* 低分辨率位点为 HLA-B*46、HLA-B*49；HLA-DR 低分辨率位点为HLA-DR*09、HLA-DR*13 （图 1）。其中 HLA-A*02 高分辨率位点为 HLA-A*0201（图 2）。

2.2 IgHV 家族表达 PCR 结果

9 例 HLA-A*0201 细胞样本进行了单克隆有限稀释法培养，获得 3 个 B 细胞克隆性细胞系。做 PCR IgHV 7 个家族的分析，其中第 1 和 7 家族放置同一管内。ZP-1 细胞 PCR 扩增结果显示其仅表达 IgHV3 家族（图 3）。证实 3 个克隆是IgHV3 家族单克隆表达的细胞系。将其中生长增殖最佳的细胞传代 80 代，命名为 ZP-1 细胞。

2.3 细胞表型分析结果（图 4）

外周血淋巴细胞来源的 ZP-1 细胞其细胞表型结果显示表达 CD4+、CD10dim+、CD19+、CD45+、anti-HLA-DR+、CD38+、anti-Lambda+。说明 ZP-1 细胞是 B 细胞来源的细胞系；CD 分子标志 CD3、CD5、CD8、CD34、CD25 和 TCRαβ、TCRγδ 不表达。

图 1 ZP-1 细胞表达 HLA-A*01、HLA-A*02、HLA-B*46、HLA-B*49 和 HLA-DR*09、HLA-DR*13Figure 1 ZP-1 cells express the HLA-A*01, HLA-A*02, HLA-B*46, HLA-B*49 and HLA-DR*09, HLA-DR*13

图 2 ZP-1 细胞 HLA-A*02 高分辨位点表达 HLA-A*0201Figure 2 The high resolution loci of ZP-1 cells for HLA-A*02 is HLA-A*0201

2.4 染色体核型分析结果

结果显示 ZP-1 细胞具有正常的核型，具体为46（XX）（图 5）。

图 3 ZP-1 细胞表达 IgHV3 家族Figure 3 ZP-1 cells express IgHV3 family

图 4 ZP-1 细胞表型流式结果显示为 CD19+、CD4+、CD10dim+、antiHLA-DR+、CD38+、antilambda+、CD45+Figure 4 The flow cytometry assay for ZP-1 phenotype are CD19+, CD4+, CD10dim+, antiHLA-DR+, CD38+, antilambda+and CD45+

图 5 正常女性核型 46（XX）Figure 5 The normal femal karyotype 46(XX)

3 讨论

在体外建立 B 细胞肿瘤细胞系已成为研究 B细胞肿瘤的重要工具。目前，尽管国内外 B 细胞肿瘤系已有 100 多种，但是迄今未见报道有同时表达 HLA-A*0201 和 IgHV3 家族的人 B 细胞系。正常 B 细胞和肿瘤细胞可以根据 B 细胞膜表面的免疫球蛋白重链框架区序列同源性分属于IgHV1 ～ V7家族中的某一个家族。已有研究证实针对框架区序列的抗原表位能够激发抗原特异的免疫反应，成为未来 B 细胞肿瘤免疫治疗的新治疗靶点[7-9]。人群中 IgHV3 家族约占 30% ～ 40% 左右，成为 IgHV1 ～ V7 家族中表达频率最高的家族。本实验从一名健康女性志愿者身上抽取外周血，分离培养建立细胞系，命名为 ZP-1 细胞。构建的 ZP-1 细胞株 PCR 结果显示表达 IgHV3 家族，可以用作过继性免疫治疗中的诱导剂，诱发特异性抗 IgHV3 抗原的细胞毒 T 细胞（CTL）产生，将这些 CTL 细胞输注给淋巴瘤细胞表达 IgHV3抗原的患者，治疗淋巴瘤。

已知 HLA 分子在参与抗原呈递识别、免疫调节遗传控制、T 细胞限制性识别等过程中起着重要作用[10-11]。其中 HLA-I 类分子在临床骨髓移植，疫苗体内免疫应答方面起着限制性作用，HLA-I 类分子中[12-14]，HLA-A*0201 在我国人群中分布最广，占 50% 左右[15]，在病毒和肿瘤抗原呈递过程中起很重要的作用[16-18]。我们对 ZP-1 细胞株采用试剂盒 PCR-SSP 方法检测 HLA 表达显示HLA-A 低分辨位点分别是 HLA-A*01、HLA-A*02；然后对 HLA-A*02 位点进行高分辨，HLA-A*0201 表达阳性。HLA-A*0201 表达阳性的ZP-1 细胞对 HLA 限定性疫苗研制试验有着重要意义。可作为疫苗试验过程中的细胞模型和实验载体。同时，我们对 ZP-1 细胞 HLA-B、HLA-DR 位点也进行了检测，结果显示为 HLA-B*46、HLA-B*49 以及 HLA-DR*09、HLA-DR*13。ZP-1的细胞免疫表型特征也做了流式细胞免疫表型分析。分析显示其 CD3–、TCRαβ–、TCRγδ–、kappa–、CD25–、CD56–、CD8–提示 ZP-1 细胞是非 T、NK 细胞来源的细胞系。CD4+、CD19+、lambda+、HLA-DR+、CD10dim+ 也进一步揭示了 ZP-1 细胞是一个 B 细胞来源的细胞系，且分泌 lambda 游离轻链。我们的染色体核型分析结果未发现有染色体易位或者其他异常，显示为 46（XX），证实 ZP-1细胞是来源于正常女性的细胞系。

在 B 细胞中，表达 HLA-A*0201 和 IgHV3家族的细胞在人群中所占比例较高具有代表意义，因而 ZP-1 细胞有望为相关疫苗研制和筛选新药提供重要的细胞模型。对 B 细胞疾病的进一步研究具有重要的作用和意义。

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ObjectiveEstablishment of human B cell line expressing specific immunoglobulin variable regions antigen.

MethodsIn the 29 cases of Epstein-Barr virus (EBV) transformed B lymphocytes to establish immortalized lymphoblastoid cell lines, PCR-SSP method detected the expression of HLA-A*0201. The HLA-A*0201(+) monoclonal cell line was obtained by limiting dilution culture, designated as ZP-1. The PCR, flow cytometry and chromosome analysis were used to detect the expression of IgHV family, phenotype CD molecules and chromosome, respectively.

Results Three HLA-A*0201(+) cell clones were aquired by monoclone culture, one of these named ZP-1 cell. IgHV3 family was detected by PCR. The B cell phenotype was identified by flow cytometry. Such as CD19, lambda chain, et al. Karyotype analysis showed that ZP-1 cells have a normal female chromosome structure.

Conclusions A human B cell line expressing specific immunoglobulin variable regions antigen was established. It provided a useful tool to develop the vaccine or molecular target drugs of B cell related diseases.

【Key words】Lymphoma, B-cell; Immunoglobulins; Vaccines

Author Affiliation: The Blood Research Laboratory, the Peking University First Hospital, Beijing 100034, China

Chin Med Biotechnol, 2010, 5(6):410-414

目的建立表达特定免疫球蛋白可变区抗原的人 B 细胞系。方法 在 29 例 EBV 转化 B 淋巴细胞建立永生化淋巴母细胞系中，PCR-SSP 方法检测 HLA-A*0201 表达的细胞系，将表达 HLA-A*0201 的细胞系通过有限稀释培养方法获得单克隆细胞系 ZP-1。分别用 PCR 方法、流式细胞仪和染色体核型分析检测细胞 IgHV 家族、细胞表面免疫表型 CD 分子和染色体核型表达。

结果HLA-A*0201(+) 的细胞，经单克隆化培养后获得3 个细胞克隆，将其中之一命名为 ZP-1。PCR 检测显示ZP-1 细胞表达 IgHV3 家族；流式细胞仪检测显示 ZP-1细胞表达 CD19、lambda 链等 B 细胞免疫表型；核型分析结果显示，ZP-1 细胞为正常女性染色体结构。

结论成功获得表达特定免疫球蛋白可变区抗原的人 B细胞系，为研发 B 细胞相关疾病的疫苗和分子靶向药物提供良好的实验基础。

Corresponding Author:ZHU Ping, Email: zhuping@bjmu.edu.cn www.cmbp.net.cn

基金项目：科技部国际科技合作重大项目（2006DFB31430）

作者单位：100034 北京大学第一医院血液研究室

通讯作者：朱平，Email：zhuping@bjmu.edu.cn

收稿日期：2010-09-29

DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.06.002

Establishment and biological characteristics of human B cell line CZ-1 expressing specific immunoglobulin variable regions antigen

LIU Hui, ZHU Ping

【Abstract】